PAK6基因對人乳腺癌放療敏感性及細胞凋亡影響及機制

宋 銳 袁金金 侯 歌 楊 軍 陳曉娟 劉宗文

(鄭州大學第二附屬醫院腫瘤放療科，河南 鄭州 450014)

乳腺癌發病率在全部惡性腫瘤中占10%左右，在女性惡性腫瘤中位居第二位，僅次于子宮癌〔1〕。乳腺癌誘發原因較多，遺傳、生活環境等均與乳腺癌的發生有關，其發病機制復雜，是多種基因共同作用的結果。目前常見的治療乳腺癌的方法有手術治療、放化療。由于大多數患者在確診時已經是乳腺癌的中晚期，放療成為治療乳腺癌的重要輔助手段〔2〕。提高乳腺癌放療敏感性成為目前研究的熱點。P21激活的蛋白激酶(PAK)6在肺癌、前列腺癌、舌鱗癌、胰腺癌等癌組織中過度表達，能夠促進腫瘤發生〔3～5〕。研究表明，抑制PAK6表達后，能夠促進癌細胞凋亡，抑制癌癥發展〔6〕。Wnt信號通路參與腫瘤發展，在腫瘤組織中過度激活，其關鍵基因β-連環蛋白(catenin)和下游靶基因c-myc均表達升高，并且參與癌基因和抑癌基因對癌癥的調控過程〔7〕。本研究旨在探討PAK6對乳腺癌細胞放療敏感性和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細胞 乳腺癌細胞MDA-MB-468購自中國科學院細胞庫。

1.2主要儀器及試劑 反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒、組織蛋白提取試劑盒均購自北京百泰克生物技術有限公司；PAK6小干擾RNA(siRNA)和陰性對照序列(siRNA對照)購自上海吉瑪生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；β-catenin單克隆抗體、c-myc單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology ；流式細胞儀購自美國BD。

1.3細胞培養及細胞轉染 乳腺癌細胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養，觀察細胞密度生長至90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。取培養至對數生長期的乳腺癌細胞，消化后，種植到6孔細胞培養板中(每孔106個細胞)培養，觀察細胞密度達到60%時，將細胞培養液換成不含胎牛血清的不完全培養液，放在37℃孵育60 min。用Lipofectamine 2000將PAK6 siRNA組和siRNA對照組轉染至乳腺癌細胞中，以未轉染組的細胞為對照，放在37℃培養48 h后，Western印跡和qRT-PCR檢測細胞中PAK6水平。

1.4qRT-PCR檢測PAK6表達 取1.3中轉染后48 h的細胞，加入Trizol裂解液混合充分裂解后，加入Trizol裂解液1/5體積的三氯甲烷，劇烈震蕩15 s，放在室溫環境下靜置15 min，12 000 r/min，4℃離心20 min，吸取水相層至EP管中，加入Trizol裂解液1/2體積的異丙醇，混合后，靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心20 min，加入乙醇洗滌兩次，晾干后，用紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度及純度。按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成PAK6 cDNA，qRT-PCR試劑盒檢測PAK6 mRNA水平。內參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。根據2-△△Ct法計算PAK6水平。△Ct=PAK6 Ct值-GAPDH Ct值。反應程序為：95℃ 3 min，95℃ 15 s，58℃ 1 min重復40個循環，72℃ 7 min。PAK6上游引物為5′-CCGAATTCATGTTTGGGAAGAAAAAGAA-3′，下游引物5′-ATCTCGAGTCGAGAGGCTGCTCTCTGATACTCC-3′。GAPDH上游引物為5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.5Western印跡檢測PAK6表達 取1.3中轉染后48 h的細胞，提取細胞中的總蛋白，BCA定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取蛋白樣品，加入等體積的2×加樣緩沖液混合后，放在100℃中煮沸5 min使蛋白變性。將變性蛋白樣品加入到上樣孔中，每孔加入50 μl的蛋白樣品，電泳初始電壓為80 V，電泳30 min后，120 V至電泳結束。將蛋白凝膠取出后，放在緩沖液中浸泡10 min。將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，轉膜條件為：100 mA。用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉30 min后，加入一抗(800倍稀釋，4℃孵育過夜)、二抗(1 000倍稀釋，室溫下孵育60 min)依次反應后，曝光，以GAPDH為內參，分析蛋白表達水平。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡 取轉染48 h后的乳腺癌細胞，吸除細胞培養液，胰蛋白酶消化后，收集3×106個細胞，冰預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸細胞兩次，加入結合緩沖液200 μl重懸細胞，各加入5 μl碘化丙啶(PI)和膜聯蛋白(V-FITC)，充分混勻后放在避光環境中，室溫靜置15 min，加入300 μl的緩沖液，用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.7細胞克隆實驗 取處于對數生長期且轉染48 h后的乳腺癌細胞，胰蛋白酶消化后，離心，棄酶消化液，接種至12孔細胞培養板中，每孔加入105個細胞，放在37℃，5% CO2培養箱中培養過夜，待細胞貼壁后，分別用0、2、4、6、8 Gy劑量照射細胞(照射條件為：200 kV，10 mA，劑量率為0.287 Gy/min)，培養12 d。肉眼觀察細胞克隆形成后，棄上清液，加入PBS洗滌細胞3次，甲醇固定30 min，結晶紫染色20 min，用自來水小心沖洗染液，在室溫下干燥。顯微鏡下觀察細胞形成的克隆數，擬合劑量存活曲線。

1.8Western印跡檢測細胞中β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表達 取對數生長期轉染后的乳腺癌

細胞，培養48 h后，Western印跡檢測細胞中β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表達。

1.9統計學處理 采用SPSS22.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.13組PAK6表達 PAK6 siRNA組細胞中的PAK6 mRNA和蛋白水平均明顯低于未轉染組(P<0.01)。siRNA對照組PAK6 mRNA和蛋白水平與未轉染組相比差異無統計學意義(P>0.05)。PAK6 siRNA能夠干擾乳腺癌細胞中PAK6的表達。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測轉染后乳腺癌細胞中PAK6表達

組別PAK6 mRNAPAK6 蛋白未轉染組1.00±0.111.32±0.08siRNA對照組1.01±0.091.34±0.14PAK6 siRNA組0.45±0.071)0.34±0.051)

與未轉染組相比：1)P<0.01

2.2各組細胞凋亡影響比較 PAK6 siRNA組細胞凋亡率〔(36.41±4.75)%〕與未轉染組〔(11.66±1.67)%〕相比明顯升高(P<0.01)。siRNA對照組細胞凋亡率〔(11.36±1.85)%〕與未轉染組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。干擾PAK6 表達能夠促進乳腺癌細胞凋亡。

圖2 干擾PAK6對乳腺癌細胞凋亡影響

2.3各組細胞放療敏感性比較 PAK6 siRNA組細胞存活分數(SF2)降低，放療增敏比為：1.896。干擾PAK6能夠增加乳腺癌細胞放療敏感性。見表2。

2.4各組β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3表達 PAK6 siRNA組與未轉染組比較，β-catenin、c-myc表達顯著降低，酶切Caspase-3表達顯著升高(均P<0.01)。見表3，圖3。

表2 單擊多靶模型參數值

圖3 Western印跡檢測干擾PAK6后乳腺癌細胞中 β-catenin、c-myc、酶切Caspase-3蛋白表達

組別β-cateninc-myc酶切Caspase-3未轉染組0.58±0.070.64±0.050.32±0.06siRNA對照組0.59±0.060.65±0070.31±0.08PAK6 siRNA組0.15±0.061)0.18±0.061)0.99±0.111)

與未轉染組相比：1)P<0.01

3 討 論

PAK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，哺乳動物含有6個亞型，在細胞形態維持、骨架支撐等方面具有調控作用〔8〕。研究表明，PAK6參與癌癥的發展，在癌癥組織中表達上調，能夠調控細胞的增殖、凋亡等過程〔9〕。Gao等〔10〕在皮膚鱗狀細胞癌組織中發現，PAK6 mRNA的表達水平是正常組織的2倍。Chen等〔11〕通過免疫組化發現，PAK6在子宮內膜癌組織和正常內膜組織中的陽性表達率分別為46.88%和22.5%。Mitsudomi等〔12〕通過轉染PAK6 siRNA發現，干擾PAK6表達后能夠抑制非小細胞肺癌侵襲，細胞侵襲能力約為原來細胞的一半。隨著研究的不斷深入，在結腸癌、胃癌、原發性肝癌等癌組織中均發現有PAK6表達異常升高〔13〕。本研究在體外以乳腺癌細胞為研究對象，通過轉染PAK6小干擾RNA進一步發現，干擾PAK6表達后能夠抑制乳腺癌細胞的凋亡，并且能夠增加乳腺癌細胞放療敏感性。溫星橋等〔14〕發現，干擾前列腺癌細胞株LNCaP中PAK6表達后能夠促進前列腺癌細胞的凋亡。Zhang等〔15〕研究表明，干擾PAK6后能夠增加前列腺癌細胞的放療敏感性，促進前列腺癌細胞凋亡。這些研究結果均說明，干擾PAK6能夠促進癌細胞的凋亡，增加癌細胞的放療敏感性。

細胞凋亡是一個復雜的過程，受到多種基因的嚴格調控，是一系列反應共同作用的結果。Caspase-3是Caspase蛋白家族的成員之一，是細胞凋亡的執行因子，Caspase-3活化后，酶切Caspase-3表達升高，細胞凋亡進入不可逆階段〔16〕。研究表明，多種抑癌基因和癌基因能夠通過調控Caspase-3的活化而干擾癌細胞凋亡過程〔17〕。本研究結果說明，干擾PAK6能夠通過作用于酶切Caspase-3而影響乳腺癌細胞的凋亡過程。

Wnt基因是從乳腺癌小鼠中克隆出來的一種癌基因，能夠促進腫瘤的發生，目前發現的有19個亞型，Wnt信號通路是一個較為復雜的信號轉導通路，由多個作用位點和多個環節共同組成〔18〕。經典的Wnt信號通路與β-catenin有關，β-catenin能夠與其他蛋白分子結合形成復合物，在外界因素的作用下，β-catenin能夠調控相關蛋白的表達〔19，20〕。c-myc是Wnt信號通路的下游靶基因，Wnt信號通路激活后能夠促進c-myc的表達〔21〕。Cleary等〔22〕在乳腺癌中有Wnt信號通路的異常激活。冬凌草甲素能夠調控Wnt信號通路影響乳腺癌MCF-7細胞的生物學特性〔23〕。 本研究結果提示，干擾PAK6能夠抑制乳腺癌細胞中Wnt信號通路的激活。

綜上所述，干擾PAK6表達能夠促進乳腺癌細胞凋亡，增加乳腺癌細胞放療敏感性，作用機制可能與抑制Wnt信號通路的激活有關。本研究只用了一種乳腺癌細胞，且只在體外進行了相關研究，后續會繼續在體內和體外繼續研究PAK6對其他幾種乳腺癌細胞凋亡及放療敏感性的影響。

4 參考文獻

1Memmi EM,Sanarico AG,Giacobbe A,etal.p63 Sustains self-renewal of mammary cancer stem cells through regulation of sonic hedgehog signaling〔J〕.Proc Nat Acad Sci U S A,2015;112(11):3499-504.

2Owens P,Pickup MW,Novitskiy SV,etal.Inhibition of BMP signaling suppresses metastasis in mammary cancer〔J〕.Oncogene,2015;34(19):2437-49.

3Raja R,Sahasrabuddhe NA,Radhakrishnan A,etal.Chronic exposure to cigarette smoke leads to activation of p21(RAC1)-activated kinase 6(PAK6)in non-small cell lung cancer cells〔J〕.Oncotarget,2016;7(38):61229-45.

4Tian X,Wei Z,Wang J,etal.MicroRNA-429 inhibits the migration and invasion of colon cancer cells by targeting PAK6/cofilin signaling〔J〕.Oncol Rep,2015;34(2):707-14.

5Morse EM,Sun X,Olberding JR,etal.PAK6 targets to cell-cell adhesions through its N-terminus in a Cdc42-dependent manner to drive epithelial colony escape〔J〕.J Cell Sci,2016;129(2):380-93.

6Zapatero A,Morente M,de Vidales CM,etal.The prognostic value of expression of HIF1α.PAK-6.and PSMB4 in intermediate-and high-risk localized prostate cancer patients treated with androgen deprivation and dose escalation radiation therapy〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys,2013;87(2):S662-3.

7Holland JD,Klaus A,Garratt AN,etal.Wnt signaling in stem and cancer stem cells〔J〕.Current opinion in cell biology,2013;25(2):254-64.

8Liu W,Liu Y,Liu H,etal.Tumor suppressive function of p21-activated kinase 6 in hepatocellular carcinoma〔J〕.J Biol Chem,2015;290(47):28489-501.

9Liu C,Zhang L,Huang Y,etal.MicroRNA 328 directly targets p21 activated protein kinase 6 inhibiting prostate cancer proliferation and enhancing docetaxel sensitivity〔J〕.Mol Med Rep,2015;12(5):7389-95.

10Gao Y,Wang W,Cao J,etal.Upregulation of AUF1 is involved in the proliferation of esophageal squamous cell carcinoma through GCH1〔J〕.Int J Oncol,2016;49(5):2001-10.

11Chen H,Miao J,Li H,etal.Expression and prognostic significance of p21-activated kinase 6 in hepatocellular carcinoma〔J〕.J Surg Res,2014;189(1):81-8.

12Mitsudomi T,Kosaka T,Endoh H,etal.Mutations of the epidermal growth factor receptor gene predict prolonged survival after gefitinib treatment in patients with non-small-cell lung cancer with postoperative recurrence〔J〕.J Clin Oncol,2005;23(11):2513-20.

13陳宏偉,王春華,李軍良,等.肝細胞癌中 p21 活化蛋白激酶 6 的表達及意義〔J〕.臨床與實驗病理學雜志,2014;30(3):313-7.

14溫星橋,李小娟,歐陽斌,等.沉默 PAK6 基因可抑制前列腺癌生長并增強多烯紫杉醇的作用〔J〕.中華實驗外科雜志,2008;25(12):1549-51.

15Zhang M,Siedow M,Saia G,etal.Inhibition of p21-activated kinase 6(PAK6)increases radiosensitivity of prostate cancer cells〔J〕.Prostate,2010;70(8):807-16.

16Sam S,Sam MR,Esmaeillou M,etal.Effective targeting survivin.caspase-3 and MicroRNA-16-1 expression by methyl-3-pentyl-6-methoxyprodigiosene triggers apoptosis in colorectal cancer stem-like cells〔J〕.Pathol Oncol Res,2016;22(4):715-23.

17Lin MT,Lin CL,Lin TY,etal.Synergistic effect of fisetin combined with sorafenib in human cervical cancer HeLa cells through activation of death receptor-5 mediated caspase-8/caspase-3 and the mitochondria-dependent apoptotic pathway〔J〕.Tumor Biol,2016;37(5):6987-96.

18Taipaleenm?ki H,Farina NH,van Wijnen AJ,etal.Antagonizing miR-218-5p attenuates Wnt signaling and reduces metastatic bone disease of triple negative breast cancer cells〔J〕.Oncotarget,2016;7(48):79032-46.

19李春輝,潘理會,佟曉波,等.Wnt 信號通路的組件蛋白 DKK-1.β-鏈接素及周期素 D1 蛋白表達與胃癌的相關性〔J〕.中國老年學雜志,2015;35(5):1171-3.

20Wang Y,He L,Du Y,etal.The long noncoding RNA lncTCF7 promotes self-renewal of human liver cancer stem cells through activation of Wnt signaling〔J〕.Cell stem cell,2015;16(4):413-25.

21Zeilstra J,Joosten SPJ,Van Andel H,etal.Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min)mice downstream of Wnt signaling〔J〕.Oncogene,2014;33(5):665-70.

22Cleary AS,Leonard TL,Gestl SA,etal.Tumour cell heterogeneity maintained by cooperating subclones in Wnt-driven mammary cancers〔J〕.Nature,2014;508(7494):113-7.

23Ren CM,Li Y,Chen QZ,etal.Oridonin inhibits the proliferation of human colon cancer cells by upregulating BMP7 to activate p38 MAPK〔J〕.Oncol Rep,2016;35(5):2691-8.