參附注射液對老年急性失血再灌注大鼠腦水通道蛋白-4的影響

曾建華 陳丹慧 王 碧 劉 旺

(貴陽中醫學院第二附屬醫院麻醉科，貴州 貴陽 550003)

參附注射液是由中醫治療厥脫證(休克)古驗方參附湯加工提煉而成，為紅參、黑附片的提取物。具有益氣溫陽的功效有多重藥學作用。參附注射液對缺血再灌注組織具有保護作用〔1〕。腦缺血可引起血腦屏障功能障礙，進而造成腦水腫，在腦細胞水調節代謝中水通道蛋白(AQP)-4起著重要作用。本文擬觀察參附注射液對老年大鼠急性缺血再灌注腦組織中AQP-4的影響，探討參附注射液是否有腦保護作用。

1 材料和方法

1.1動物及分組 選取16～19月齡SD大鼠70只〔SPF級，雌雄各半，體質量(250±20)g，購自長沙市天勤生物有限公司〕。隨機分為8組。A組：假手術組；B組：放血組；C組：5%葡萄糖氯化鈉組；D組：5%葡萄糖生理鹽水加參附注射液組；E組：膠體組(6%羥乙基淀粉溶液)；F組：參附注射液加膠體組；G組：血液組；H組：血液加參附注射液組。每組7只。剔除因飼養原因死亡的大鼠9只，因造模失敗的大鼠5只。

1.2試劑及設備 5%葡萄糖生理鹽水；6%羥乙基淀粉溶液(北京費森尤斯卡比醫藥有限公司)；參附注射液(雅安三九制藥有限公司)；肝素；肝素抗凝管；10%水合氯醛；AQP-4購自上海藍基生物技術有限公司(生產批號：20131209)；UV2501PC型紫外分光光度計(日本島津分類號：03040426)；HHW-420三用數顯恒溫水浴箱(金伝億通電子有限公司)；TP-213電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；MULTISKAN GO酶標儀(Thermo Fisher科技公司)；LEGEND MICRO ZIR離心機(Thermo Fisher科技公司)；MULTIFUGE X1R離心機(Thermo SCIENTIFIC)；漩渦混勻器、微量移液器等。

1.3失血模型的建立 術前禁食、禁飲6 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液(10 ml/kg),麻醉下行氣管切開術，與小動物呼吸機連接，行機械通氣,維持呼氣末二氧化碳分壓為30～40 mmHg。剝離左頸靜脈和右頸總動脈，經頸淺靜脈以1 ml/kg劑量注射1%肝素鈉全身抗凝后行動、靜脈插管、備輸液及放血。頸總動脈插管為三通管，連接生物信號采集系統，連續記錄各組平均動脈壓(MAP)。穩定15 min后，模型組勻速放血至MAP為40 mmHg(5.3 kPa)左右(35～45 mmHg)，放血時間為5 min，維持低血壓60 min，復制失血性休克模型。假手術組不進行放血處理。

1.4試驗方法 失血性休克模型動物在維持低血壓60 min后，經由頸靜脈緩慢進行全血及液體復蘇，輸液速度為0.5 ml/min，輸液時間為20 min左右。其中，C組推注5%葡萄糖氯化鈉溶液(2 ml/kg)、D組推注參附溶液(參附注射液1 ml/kg，加入等量的5%葡萄糖氯化鈉溶液稀釋至2 ml/kg)、E組推注羥乙基淀粉溶液(2 ml/kg)、F組推注參附溶液(1 ml/kg，以羥乙基淀粉溶液稀釋至2 ml/kg)、G組推注該動物的血液、H組推注參附溶液(1 ml/kg，預先混入血液中)，補液量與放血量相等(或補液量以MAP為標準，當MAP恢復至放血前的水平即停止輸液)；A組不放血、不輸液，僅實施手術；B組放血、不輸液；觀察2 h。

1.5檢測指標 ①大腦組織含水量：2 h后迅速處死大鼠，取左側大腦精密稱定濕質量，置于60℃恒溫烘箱48 h后再精密稱定干質量。計算腦組織含水量公式如下：腦組織含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%；②腦組織AQP-4的表達 處死大鼠，取右側大腦，加入生理鹽水適量制成20%腦組織勻漿備用，照試劑盒說明書進行。

1.6統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1各組大腦組織含水量的比較 D、F、G、H組腦濕重顯著低于B組(P<0.05，P<0.01)；D、H組腦濕重顯著低于C組(P<0.05)；E組腦濕重顯著高于D組(P<0.05)；G組腦濕重顯著低于E組(P<0.05)。D、F、G、H組腦干重顯著低于B組(P<0.05)；D組腦干重顯著低于C組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大腦組織含水量及AQP-4表達比較

與A組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與B組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與C組比較：5)P<0.05,6)P<0.01；與D組比較：7)P<0.05；與E組比較：8)P<0.05

2.2各組腦組織AQP-4表達比較 B、C、D、E、F、G、H組AQP-4表達均顯著高于A組(P<0.05，P<0.01)；C、E組AQP-4的表達顯著高于B組(P<0.01)；D組AQP-4的表達顯著低于C組(P<0.01)。見表1。

3 討 論

急性大量失血后體循環容量減少，可使全腦血流量減少，腦灌注壓下降；同時，急性貧血可導致血液系統攜氧能力降低，使局部組織缺氧〔2〕，腦血流減少，可引發選擇性的神經細胞損傷；而腦缺血后再灌注早期會發生血腦屏障轉運系統變化，導致血腦屏障急性或嚴重的慢性滲透性的改變，引起腦水腫〔3〕。雖然對于腦水腫發生的機制尚存在眾多爭議，但大量的研究認為，AQP-4對于腦水腫的發生和消退有重要作用。AQP-4在腦內主要表達于室管膜細胞、星形膠質細胞、軟腦膜、脈絡叢、室旁核和下丘的視上核，具有選擇性轉運水的功能〔4，5〕，但AQP-4在腦缺血后再灌注引起的腦水腫周圍組織中表達的時間窗問題上尚無定論。因此，中藥針對缺血后再灌注損傷治療時機的把握也存在爭議。參附注射液對腦缺血再灌注組織具有保護作用，其可能的機制是擴張血管和改善腦內血流〔6〕。

從本研究可以看出，失血性休克早期即可觸發AQP-4表達，而早期應用參附注射液可以改善腦內血流，抑制AQP-4 的表達。由此可以推論AQP-4在失血性休克早期的高表達，可能起到維持腦內水平衡的作用，而不是單純地加重腦水腫。而參附注射液可能是通過抑制AQP-4表達，以改善腦血流的作用。綜上，急性失血后再灌注早期應用參附注射液可降低AQP-4的表達，改善腦血流，但是AQP-4在急性失血后的高表達是否可促進腦水腫發生，參附注射液抑制AQP-4的表達是否可改善失血后再灌注損傷的預后，還有待研究。

4參考資料

1謝 健，閔 蘇.參附注射液對缺血再灌注損傷保護作用的研究進展〔J〕.重慶醫藥，2006;35(2)：2099-100.

2呂一冬，劉秀珍，王宏月,等.大量失血對老年大鼠空間學習記憶能力的影響〔J〕.重慶醫藥，2015;44(1)：158-61.

3莊心良，曾因明，陳伯鑾.現代麻醉學〔M〕.第3版，北京：人民衛生出版社，2004：28-33.

4夏文政，胡韶山.水通道蛋白4與腦水腫研究進展〔J〕.現代生物醫學進展，2015;15(4)：768-70.

5任非非，劉敬霞.中醫藥調控水通道蛋白4保護腦缺血再灌注損傷的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(4)：1990-3.

6薛 麗，丁小英，張紅莉,等.參附注射液對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的研究〔J〕.山東醫藥，2004;44(22)：20-1.