Hedgehog信號通路抑制劑對轉化生長因子-β1誘導人膽管癌細胞生物學行為的影響

曲義坤 國麟祺 陳 剛 徐 劍 程卓鑫

(佳木斯大學附屬第一醫院普外科，黑龍江 佳木斯 154000)

膽管癌侵襲能力及轉移能力都很強，在早期就容易發生遠處轉移〔1〕。目前治療此疾病的最有效方法是根治性手術，但大多數患者就診時便失去了手術的機會。與此同時，膽管癌對放化療不敏感，因此，臨床上患者的5年生存率較低，且預后較差〔2〕。有學者提出，膽管細胞發生上皮間質轉換(EMT)是其侵襲轉移前的主要步驟，而轉化生長因子(TGF)-β1因子是誘發EMT形成的最主要的因素〔3〕。本研究分析Hedgehog信號通路抑制劑對TGF-β1誘導人膽管癌細胞(RBE)生物學行為的影響。

1 資料與方法

1.1材料與試劑 肝膽管癌細胞(中國科學院上海細胞庫)、Hedgehog信號通路信號抑制劑環杷明(Selleckchem)、TGF-β1誘導劑(Selleckchem)、RPMI1640(Transgenbiotech)、優質的胎牛血清(HyClone)

1.2細胞培養 將購買的10%新鮮的胎牛血清融入RPMI1640培養基，而后對人膽管癌細胞(RBE)進行接種，待接種完全后，將培養基放入培養箱中進行培養，培養環境要求溫度設定為37℃，CO2的濃度為5%，保持周圍環境的清潔。細胞培養期間一旦發現細胞死亡，立即停止實驗，并重新開始。當細胞處于成對數生長期時，選取細胞進行實驗，并用TGF-β1誘導RBE細胞增殖。

1.3加入環杷明溶液，并對其行細胞計數法檢測 對上述收集的細胞進行觀察，確定選擇細胞健康存活且處于呈對數生長期。將其接種于6孔板上，其密度要求為1×104/cm2。此時，配置5、10、15、20、40 μmol/L的不同濃度的環杷明溶液。觀察細胞生長情況，待到融合度為75%左右，加入不同濃度的環杷明溶液。隨后用胰酶處理6孔板內的細胞，并選用臺盼藍進行染色處理，根據所顯現的顏色，進行計數，隨后計算活細胞率。而后，選擇濃度為20 μmol/L的環杷明溶液為不變量，將培養時間為可變量，分別為1、2、3 d，隨后采用上述方法，計算活細胞比率。

1.4檢測環杷明溶液對RBE活性的影響 首先，先用胰酶處理細胞，將其制作成細胞懸濁液，濃度要求為5.5×107/L，隨后接種至含96的孔板上。加入不同濃度的環杷明溶液，操作同1.3。將不加入環杷明溶液的一組作為空白對照組進行實驗，其余操作同實驗組。選用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5二苯基四氮唑嗅鹽(MTT)法來檢測Hedgehog信號通路抑制劑環杷明對REB的活力影響。隨后選用MTT法檢測環杷明對REB增殖的影響，以抑制率為指標進行判斷。抑制率的計算方式為：抑制率(%)=〔1-(實驗組吸光度-空白組吸光率)/(對照組的吸光率-空白組的吸光率)×100%〕〔4〕。吸光率使得測定設定的酶標儀的波長為490 nm。而后，固定環杷明的濃度為20%，將時間作為變量(1、2、3 d)，用上述方法，計算抑制率。

1.5Western印跡法測定 采用Western印跡法測定RBE產生的Glil蛋白及Smo蛋白的表達數量。

1.6統計學方法 應用SPSS18.0軟件行χ2、t檢驗。

2 結 果

2.1環杷明對RBE的影響 經過環杷明處理過的RBE放置差相倒置顯微鏡下進行觀察，鏡下結果顯示，REB的生長速度明顯減緩，且細胞體積較不處理的細胞變小，形態更圓；其余的結構也發生變化，例如：細胞間的連接較正常細胞減少，少數甚至消失，大部分細胞由于脫水導致皺縮、細胞核固縮現象出現，這說明經環杷明的處理，對RBE產生了破壞〔5,6〕。此外，隨時間的延長，這種現象也更為明顯(見圖1)。而經處理后的RBE，經過臺盼藍染色計數、經MTT法檢測抑制率，結果顯示，濃度為5、10、15、20、40 μmol/L的環杷明都可以通過調控Hedgehog信號通路而對REB的活性及增殖產生明顯的抑制作用，且與空白對照組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。而控制環杷明的濃度，將時間作為變量的實驗中，發現經環杷明處理時間越長，RBE的生長能力越弱(P<0.05)，見表1、表2。

圖1 差相倒置顯微鏡下RBE的形態(×200)

項目空白對照組環杷明5 μmol/L10 μmol/L15 μmol/L20 μmol/L40 μmol/L細胞增殖率100801)621)581)441)301)細胞抑制率0311)521)491)511)611)

與空白對照組比較：1)P<0.05

表2 不同作用時間環杷明對RBE增殖和抑制的影響(%)

與0 h比較：1)P<0.05；表3同

2.2環杷明對RBE表達蛋白Glil和Smo的影響 不經過環杷明處理過的RBE表達的Glil及Smo的數量較高，而經過環杷明處理后的REB所翻譯出兩種蛋白質的量皆有所減少(P<0.05)；而且隨著環杷明處理的時間越長，其表達數量越低(P<0.05)，見表3。

表3 環杷明處理不同時間對RBE表達蛋白Glil和Smo影響

3 討 論

膽管癌的癌變細胞主要是肝內膽管的上皮細胞。當前，最主要、最有效的治療方法為手術根治切除術。然而，由于其轉移時間早、侵襲性強。所以傳統的手術治療后，其預后效果較差，而5年生存率也仍舊較低〔7,8〕。近年來，膽管癌的發病率持續增高，治療此疾病的關鍵是早期診斷和治療〔9〕。經查閱資料〔10〕發現，Hedgehog信號通路、TGF-β、Notch對腫瘤的發生具有促進作用。

在某些因素的作用下，如感染、重度、創傷，上皮細胞可以發生化生作用，由其原本的形態轉變為纖維樣細胞的形態〔11〕。這就使得細胞的極性喪失，并且細胞間的連接明顯減弱，這就使得癌細胞的遷移及侵襲的能力增強。從而使細胞獲得了間質細胞所具有的形態和特性，這種變化將其稱之為EMT〔12〕。而EMT的主要特點就是上皮細胞極性的喪失和具有間質特殊性的獲得。這一變化，是腫瘤早期轉移的主要原因。在EMT的過程中，上皮細胞所表達的E-聯環素、a-聯環素、p-聯環素水平下調〔13〕。腫瘤細胞發生EMT是癌細胞侵襲轉移的必要條件。研究〔14〕發現，TGF-β1可以誘導RBE增殖。

Hedgehog信號通路在人類的早期器官的發育及發育成熟后的組織修護中有高度的保守性，這就對維護機體器官、組織甚至細胞的正常狀態起到了重要的作用〔15〕。此信號通路只有在其受體與配體結合后才能被激活，激活后的Hedgehog信號通路可以解除對Smo的抑制作用，隨后，Smo具有激活Glil的作用，激活的Glil可以被轉運至細胞核，而后目的靶基因被激活發生轉錄，從而對染色的形成、細胞周期的活動，甚至對細胞的生長、運動、凋亡都起到調節作用〔16〕。有研究〔17〕證明，很多腫瘤的發生，如結腸癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、食管癌都與Hedgehog信號通路的激活關系密切。因此，特異性阻斷劑環杷明可以通過阻斷Hedgehog信號通路而抑制細胞反應。

環杷明的作用機制主要是在作用于Smo后抑制通路的活性。而它并不屬于全身性的化療藥物，因此，用其治療，對患者機體其他的組織器官并不會產生嚴重的副作用〔18〕。而Glil是位于Smo下游的一個因子，有著承上啟下的調控作用。本研究與以往的相關研究〔19〕有著高度的一致性。本研究結果說明經環杷明的處理，對RBE細胞產生了破壞。此外，隨時間的延長，這種現象也更為明顯。本研究結果表明，環杷明可以很好地抑制RBE增殖，且這種關系有著劑量依賴性和時間依賴性。Hedgehog信號通路具有維持RBE增殖的作用，要想治療膽管癌細胞可以考慮阻斷這一信號通路。這與Thayer等〔20〕在胰腺癌得到的結論不謀而合。造成這一現象的機制可能是由于環杷明可以通過對抗Smo進一步控制Clil，Clil直接使血小板源性生長因子受體(PDGF)Rα及B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl)-2的表達降低，而凋亡細胞因子(Fas)和死亡受體(DR)5的表達升高。FAS及DR5都具有誘導細胞凋亡的活性，而Bcl-2可以經由多種途徑進行調控，從而促進凋亡。以此推測，環杷明在抑制細胞增殖的過程可能與促進細胞凋亡的過程相互影響。

綜上，環杷明作為特異性抑制劑可以通過阻斷Hedgehog信號通路而對TGF-β1誘導的RBE細胞生物學行為學產生影響，主要可以抑制其增殖，其發生機制可能與抑制Glil及Smo蛋白的表達有關。

4 參考文獻

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