七氟烷預處理對缺血再灌注損傷大鼠神經功能及血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平的影響

王 濤 鄭洪洪 徐志新

(海南醫學院第二附屬醫院麻醉科，海南 海口 570311)

腦缺血可導致氧和葡萄糖運輸障礙，造成局部組織能量代謝障礙，出現缺血性損傷，而在再灌注恢復血液后，其缺血性損傷會進一步加重，這種現象稱為腦缺血再灌注損傷〔1，2〕。腦缺血再灌注損傷是一個復雜的過程，在腦組織缺血缺氧的基礎上，血液灌注后可產生氧化作用，生成活性氧簇及活性氮簇，進而損傷腦細胞，破壞細胞能量代謝；同時，腦缺血再灌注還可導致白細胞積聚、炎性損傷、細胞內Ca2+超載、興奮性氨基酸釋放，這些病理變化都可以對腦組織產生很大的影響，其中影響最大的就是腦水腫和神經元損傷〔3，4〕。腦缺血再灌注后對中樞神經系統造成的損傷通常是由能量代謝障礙引起的，而受損的神經元可在細胞間傳遞炎癥信號，放大炎癥反應，引起單核細胞、中性粒細胞大量聚集，引發繼發性損傷。由此可見，在腦缺血再灌注損傷中炎癥性損傷是重要的組成部分〔5，6〕。七氟烷為含氟的吸入麻醉藥，其最小肺泡濃度(MAC)穩定，具有起效快、蘇醒快等特點，且組織溶解性和在體內的代謝程度均較低，不增加腦血流量〔7〕。相關研究顯示〔8〕，七氟烷預處理對中樞神經系統損傷具有一定的保護作用，然而關于七氟烷預處理對腦缺血再灌注引起的中樞神經系統損傷的相關報道目前較少。本研究旨在探討七氟烷預處理對缺血再灌注損傷大鼠神經功能及血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-10、IL-1β水平的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取無特定病原體的Wistar雄性大鼠36只，體重180～200 g，平均(190.11±6.58)g，室溫保持20℃～25℃，濕度50%～65%，每天給予12 h光照時間，保持室內通風，避免噪聲，自由飲食、活動。實驗大鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2012-0001。適應性喂養1 w后采用隨機數字表法分為對照組(10只)、模型對照組(13只)和七氟烷組(13只)。

1.2實驗方法 對照組和模型對照組大鼠吸入100%純氧，60 min后進行后續處理。七氟烷組吸入七氟烷，濃度配比為2.5%七氟烷+97.5%氧氣，保持自主呼吸60 min后采用純氧洗脫15 min，然后進行建模處理。建模方法〔9〕：采用烤燈維持大鼠體溫，使其體溫在建模過程中保持在37℃～38℃，采用10%水合氯醛350 mg/kg進行麻醉，腹腔注射。大鼠仰臥位固定，常規消毒后于大鼠頸部正中作一切口，鈍性分離各層組織，暴露右側頸總動脈，分離右側頸總動脈及頸外動脈，避免損傷迷走神經和氣管，于頸內、頸總動脈處用動脈夾夾閉，頸外動脈近心端及遠心端結扎，中間剪開切口，將頸外動脈游離端拉至與頸內動脈成一條直線，將尼龍線由頸外動脈插入，推入約18 mm，當感受到阻力時停止推入。夾閉血管缺血2 h后將尼龍線拔出，再灌注恢復血液流通。對照組大鼠僅進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及插入尼龍線。建模后密切關注模型對照組和七氟烷組大鼠，采用Bederson評分評估建模情況，舍去行為完全正常的大鼠，同時舍去手術時出血較多、癥狀很重或死亡的大鼠(這部分大鼠可能會出現出血性腦損傷)，經評估后模型對照組和七氟烷組均有10只大鼠符合標準。

1.3大鼠神經功能檢測 再灌注24 h后，采用Garcia評分量表評估大鼠的神經功能，該量表主要從自主活動、提尾懸空時四肢活動對稱情況、提尾至桌面邊緣時前肢伸展情況、攀爬和抓持鐵籠的能力、身體感覺反應、兩側胡須觸覺反射情況這6個方面進行考察，每個方面均根據情況給予0～3分，總分為18分，分數越低說明神經功能受損越嚴重。該步驟由同一名不清楚分組情況的實驗員完成，以更加客觀地進行評判。

1.4血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平檢測 大鼠再灌注24 h時采集股動脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，提取上層血清。采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平，試劑盒均購于上海酶聯生物科技有限公司。采用96孔板，設立標準孔，于每孔中分別加入稀釋好的標準品稀釋液50 μl，設立空白孔和待測樣品孔，均加入樣品稀釋液40 μl、待測樣品10 μl，晃動混勻，封膜室溫孵育30 min，倒掉液體，甩干，洗滌緩沖液清洗，甩干，除空白孔外，每孔加入對應的酶標試劑50 μl，封膜室溫孵育30 min，倒掉液體，甩干，洗滌緩沖液清洗，甩干，每孔均加入A、B顯色劑50 μl，晃動混勻，室溫避光孵育15 min，每孔加入終止液50 μl。采用酶標儀(BIO-RAD 680，美國)檢測各孔位的光密度值，波長450 nm，以空白對照組校零。

1.5腦梗死面積比較 完成上述實驗后斷頭處死所有大鼠，迅速取出腦組織置于-20℃保存，10 min后取出，切除小腦、低位腦干、嗅球等部位，然后進行連續冠狀切片，將切片置于2%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min，TTC染色后正常腦組織區域為紅色，腦梗死區域為白色，拍照后用圖像分析系統軟件計算腦梗死面積百分比。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1三組大鼠的神經功能比較 三組大鼠的神經功能評分整體比較差異有統計學意義(F=611.164，P=0.000)，七氟烷組(12.20±1.12)和模型對照組(7.10±0.53)大鼠神經功能評分明顯低于對照組(18.00±0.00)，七氟烷組大鼠神經功能評分明顯高于模型對照組(P<0.05)。

2.2三組血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平比較 三組血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平整體比較差異有統計學意義(P<0.05)，七氟烷組和模型對照組血清TNF-α、IL-1β水平明顯高于對照組，IL-10水平明顯低于對照組(P<0.05)；七氟烷組血清TNF-α、IL-1β水平明顯低于模型對照組，IL-10水平明顯高于模型對照組(P<0.05)。見表1。

表1 三組血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型對照組比較：2)P<0.05

2.3三組大鼠腦梗死面積百分比比較 三組大鼠的腦梗死面積百分比整體比較差異有統計學意義(F=12 269.165，P=0.000)，七氟烷組〔(10.14±0.22)%〕和模型對照組〔(16.21±0.34)%〕腦梗死面積百分比明顯高于對照組〔(0.00±0.00)%〕，七氟烷組大鼠腦梗死面積百分比明顯低于模型對照組(P<0.05)。

3 討 論

腦組織貯氧量低，但耗氧量占全身總耗氧量的20%左右，因此，腦組織對缺血、缺氧非常敏感，長時間的缺血可導致腦組織出現不可逆損傷，盡快恢復正常的血液流通是治療腦缺血的基礎。然而，腦缺血再灌注可進一步對腦組織造成傷害，增加腦缺血患者的治療難度。因此，探究腦缺血再灌注損傷的防治方案具有重要的臨床意義〔10〕。目前臨床上常用的缺血再灌注損傷的防治方案主要包括缺血預處理、缺血后處理、亞低溫療法、阻止細胞內Ca2+超載、減少自由基生成、抗炎癥反應、吸入性麻醉劑等〔11〕。吸入性麻醉劑具有安全可靠、易于控制等特點，是臨床全麻手術常用的麻醉方式。相關研究發現〔12〕，吸入性麻醉劑可減輕腦、腎臟、肝臟、心臟等由缺血再灌注引起的損傷。七氟烷是一種吸入性麻醉藥，相關研究結果顯示〔13〕，七氟烷可降低腦缺血再灌注模型大鼠血清中的炎癥因子水平，減輕炎癥反應，進而起到腦保護作用。

腦缺血發生后活性氧簇及活性氮簇含量增加，二者可相互作用形成過氧亞硝酸鹽，進而對神經元造成損傷。同時，腦缺血再灌注后的細胞內Ca2+超載、氧化應激反應、能量代謝障礙等可促進線粒體通透性轉換孔過度開放，導致線粒體基質滲透壓明顯上升，出現線粒體腫脹、外膜破裂，細胞色素C進入細胞質，激活細胞凋亡相關因子Caspase-3，導致神經元細胞凋亡〔14〕。本次研究提示腦缺血再灌注可對神經功能造成損傷，而七氟烷預處理可降低這種損傷，起到保護大鼠神經功能的作用。TNF-α和IL-1β是常見的炎癥因子，在腦缺血再灌注損傷中起到重要作用。發生腦缺血再灌注后中性粒細胞聚集、浸潤，與血管周圍的巨噬細胞產生TNF-α、IL-1β等多種炎性因子，發生炎癥反應，損傷腦組織〔15〕。IL-10是天然免疫過程中的重要調節因子，可抑制巨噬細胞產生TNF-α、IL-1β等多種炎性因子，進而降低炎癥反應〔16〕。在本次研究中，建立腦缺血再灌注模型后大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平增加、IL-10水平降低，而七氟烷預處理可緩解這種趨勢，降低炎癥反應。本研究結果還顯示，七氟烷預處理可減少腦缺血再灌注模型大鼠的腦梗死面積，能對腦起到保護作用。七氟烷預處理能抑制血管擴張，降低代謝程度，進而延緩氧和葡萄糖的使用速度，減輕腦缺血引起的乳酸堆積，并且能抑制自由基合成和脂質過氧化反應，減輕氧化性損傷〔17〕。另外，余瓊等〔18〕研究顯示，七氟烷預處理可抑制血管細胞黏附分子(VCAM)-1、細胞間黏附分子(ICAM)-1、基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9上調，而上述四種指標均含有核轉錄因子-κb 反應元件。已有研究證明〔19〕，核轉錄因子-κb 拮抗劑可緩解腦缺血再灌注損傷。因此，可以推測，七氟烷抑制VCAM-1、ICAM-1、MMP-2、MMP-9表達也是其改善腦缺血再灌注損傷的機制之一。

綜上所述，七氟烷預處理可有效改善缺血再灌注損傷大鼠神經功能，并可降低血清TNF-α、IL-10、IL-1β水平，減輕腦缺血再灌注后的腦梗死面積，對腦組織有一定的保護作用。

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