應用于生物醫(yī)療領域的碳納米點及其復合物

王曉筠，李 波，陳 力，李 迪，曲松楠，李志民*

(1.吉林大學 口腔醫(yī)院，吉林 長春130021; 2.吉林大學 第二醫(yī)院，吉林 長春130000；3.中國科學院 長春光學精密機械與物理研究所，吉林 長春 130033)

1 引 言

碳納米點作為新興的碳納米材料，以其優(yōu)異的化學、物理性能成為納米材料領域的研究熱點[1-3]。碳納米點(石墨烯量子點)是零維納米材料，其尺寸通常小于10 nm，通過自上而下或自下而上的方法合成，中心為碳核結構，表面具有氨基、羧基等多種官能團，水溶性好，易于化學修飾。碳納米點具有高效熒光發(fā)射特性，包括依賴激發(fā)波長的熒光發(fā)射特性、發(fā)射波長在藍光至近紅外區(qū)域連續(xù)可調、高熒光量子效率、以及良好的光穩(wěn)定性等。同時，碳納米點具有高效的光生電荷分離和轉移特性，通過其豐富的表面反應位點實現(xiàn)與其它功能材料的有效復合，并為碳納米點復合物實現(xiàn)新的性能。

由于具備制備成本低、尺寸小、低毒、生物相容性高、水溶性好、易修飾、光物理性質獨特等諸多優(yōu)點，碳納米點在生物醫(yī)療領域展現(xiàn)了獨有的優(yōu)勢和應用前景[4-7]。目前，隨著碳納米點合成方法的完善，吸收、發(fā)射光譜范圍的拓寬，以及熒光量子效率的提高，碳納米點及其復合物已經(jīng)廣泛的應用于熒光成像、生物傳感、載藥、基因傳遞以及腫瘤治療中，并取得了引人矚目的研究進展。其中，碳納米點的熒光成像特性是其傳感、藥物示蹤、診斷等應用的基礎，目前已被廣泛報道和總結[8-14]。進一步，以碳納米點的化學、物理特性為基礎開發(fā)應用于腫瘤等重大疾病診斷和治療的碳納米點生物醫(yī)療試劑，是碳納米材料和納米醫(yī)療領域的重要研究方向。本文將關注應用于診斷治療領域的碳納米點及其復合物的設計、構建及性能研究，對已報道的基于碳納米點的診斷治療試劑在生物醫(yī)療領域的研究進展進行總結和討論。

2 碳納米點的化學、物理特性

2.1 碳納米點的結構和組成

碳納米點(石墨烯量子點)為碳基、石墨化的納米粒子，尺寸通常小于10 nm，中心為納米尺度下不同程度氧化的石墨結構，表面帶有羧基等官能團。碳納米點由sp2和sp3雜化的碳原子、橋連及端基氧原子、氫原子、雜原子(氮、硫、硒、磷、硼等摻雜原子)以及缺陷組成。大部分報道的碳納米點都可以從高分辨透射電子顯微鏡照片中觀測到局域清晰的由碳原子組成的晶格，分別為石墨的平面內堆積(晶格間距0.18～0.24 nm)和層間堆積(晶格間距約0.334 nm)，證明了碳納米點的石墨化結構[15]。除C、O、H外，通過原料選擇和化學摻雜手段，碳納米點內核和表面官能團中可以實現(xiàn)N、S、Se、P、B等主族元素的摻雜，并改變碳納米點的物理、化學性質。

2.2 碳納米點的合成方法

表1 碳納米點合成方法及特點總結

碳納米點原料來源十分廣泛，合成方法簡單多樣，主要分為自上而下和自下而上兩類(表1)。自上而下法是利用物理方法(弧光放電、激光燒蝕、超聲)、電化學剝離法、化學法(強酸氧化、水熱、溶劑熱)等打破石墨類(碳納米管、氧化石墨烯、石墨烯等)材料的碳骨架獲得小尺寸碳核并將活性氧基團(環(huán)氧基、羰基等)接入碳核的內部和表面。由于大量表面缺陷的存在，大部分自上而下方法獲得的碳納米點熒光量子效率較低(<10%)，通過表面修飾有機小分子或低聚物可以提高碳納米點的熒光量子效率。2004年，Scrivens等人通過制備電泳純化單壁碳納米管時首次獲得熒光碳納米粒子[16]。2006年，Sun利用激光燒蝕石墨粉制備碳納米點，并在碳納米點表面共價接枝聚乙二醇(PEG1500N)進行表面鈍化，獲得了激發(fā)波長依賴的藍光至紅光發(fā)射的碳納米點，熒光量子效率4%～10%[17]。與自上而下法相反，自下而上法是通過有機小分子逐步合成或熱解碳化完成聚合、成核、尺寸生長過程合成碳納米點。自下而上法原料來源極為廣泛，利用富碳的有機酸、有機胺、氨基酸、有機多羥基化合物、聚合物、天然原料等通過溶液化學合成、水熱、溶劑熱、微波、表面等離子體等多種合成方法均可制備出具有相似或不同結構和性質的碳納米點。檸檬酸含碳量高，碳化溫度低，易與有機胺類化合物脫水聚合形成六圓環(huán)結構，為自下而上法合成碳納米點最常用的有機碳源。Yang等人用水熱法將檸檬酸和乙二胺聚合碳化合成了碳納米點，產(chǎn)率為58%[18]。我們首次以檸檬酸和尿素為碳源用微波法(750 W,4～5 min)合成了具有高生物相容性的綠光發(fā)射碳納米點[19]，并在檸檬酸和尿素的原料體系中通過能帶調控手段獲得藍光和橙紅光發(fā)射的碳納米點[20-21](圖1)。 此外，碳納米點的尺寸和形貌可以通過控制合成條件和選擇模板進行調控[22-23]。

圖1 (a)以檸檬酸和尿素為原料通過脫水和進一步碳化合成碳納米點的示意圖。通過調節(jié)碳基內核的共軛程度所獲得的藍光、綠光、紅光發(fā)射的碳納米點的吸收(b)和發(fā)射(c)光譜[20-21] Fig.1 (a)A schematic illustration for the formation of carbon nanodots from citric acid and urea through dehydration and following carbonization. The absorption(b) and emission(c) spectra of blue, green and orange emissive carbon nanodots obtained by tuning the conjugation degree of carbon-based cores[20-21]

到目前為止，大部分直接制備的碳納米點為多種尺寸碳納米點的混合物，獲得單一尺寸分布的碳納米點需要進一步提純。常用的提純方法包括離心、透析、超濾、凝膠電泳、柱層析、高效液相色譜法等，我們以檸檬酸和氨水為原料用微波法(650 W,5～6 min)制備碳納米點，通過離心法分離獲得了小尺寸(1～7 nm)藍光發(fā)射和大尺寸(10～60 nm)綠光發(fā)射的碳納米點，并通過離心分離抑制小尺寸碳納米點向大尺寸碳納米點的能量轉移，使得藍光發(fā)射的碳納米點熒光量子效率提高到39%[24]。Xiong等人以尿素和對苯二胺為原料在水熱條件下(160 ℃,10 h)一步合成碳納米點，通過柱層析分離獲得藍光至紅光發(fā)射的系列碳納米點單色發(fā)光組分，發(fā)射光譜的不同是由各碳納米點組分表面官能團的氧含量不同造成的[25]。除了制備和提純之外，碳納米點豐富的表面官能團使得碳納米點的表面修飾簡單易行，并為碳納米點獲得新的特性和復合物的制備提供條件。碳納米點的表面活性官能團主要為羧基和氨基，其修飾可通過靜電相互作用、氫鍵以及共價鍵實現(xiàn)。我們利用氫鍵和可能的靜電相互作用構筑了具有可見-近紅外吸收的碳納米點聚集體(超碳納米點)[20]。在共價修飾過程中，通過酰胺化反應實現(xiàn)碳納米點的表面修飾是最為常見的方法。Sun等人將表面富羧基的碳納米點在二氯亞砜中反應形成酰氯，進而進攻表面鈍化劑端位胺基形成酰胺，實現(xiàn)PEG、乙二胺(EDA)等對碳納米點的表面鈍化[17,26]。Yang等人利用碳二亞胺法(EDC/NHS反應)活化碳納米點表面羧基形成NHS酯，進一步與含胺基的gIgG抗體形成酰胺[27]。Sun等人利用EDC/NHS反應活化奧沙利鉑的羧基，與表面富胺基的碳納米點形成酰胺構筑復合物[28]。另外，碳納米點表面氨基的烷基化反應[29-30]、與異硫氰酸酯、二硫化碳等反應均可實現(xiàn)碳納米點的表面修飾[31]。

2.3 碳納米點的光物理性質

區(qū)別于石墨烯等傳統(tǒng)的碳納米材料，碳納米點良好的發(fā)光特性成為其最具代表性的特點之一。碳納米點的吸收主要集中于紫外區(qū)，其帶邊拖尾延長至可見-近紅外區(qū)。高能紫外吸收(～260 nm)來源于sp2雜化平面的π-π*躍遷，略低帶隙的吸收(～300 nm)能量從高到低依次來源于平面間π-π*躍遷和n-π*躍遷[32]，另外，元素摻雜、表面官能團、表面鈍化等都會影響碳納米點的吸收光譜。在紫外波段激發(fā)下，很多碳納米點的主要發(fā)射峰位于藍光區(qū)，大部分研究者認為是由于n-π*躍遷引起的發(fā)光[33]。隨著激發(fā)波長紅移，很多碳納米點的發(fā)射峰表現(xiàn)出激發(fā)波長依賴的特性，發(fā)生紅移，這是碳納米點獨特的光物理特性之一。目前，由于碳納米點的個體多樣性和未探明的精確結構，其發(fā)光機制尚不明確，除尺寸效應外，大量研究證明表面態(tài)對碳納米點發(fā)光特性的影響十分重要。Lin等人利用檸檬酸在甲酰胺中溶劑熱反應合成了具有激發(fā)波長依賴特性的全色發(fā)光碳納米點，且長波長區(qū)發(fā)射強度未發(fā)生明顯降低，并證明碳納米點內部具有多重發(fā)光中心[34]。對于部分發(fā)光具有激發(fā)波長依賴特性的碳納米點，可以通過化學分離獲得具有單一發(fā)射波長的多個發(fā)光單元，發(fā)光單元具有不同的尺寸或組成特性[25,35-36]。目前，通過原料體系的選擇以及合成方法的調控，具有非激發(fā)波長依賴發(fā)光特性的碳納米點已被廣泛報道，通過能級和表面態(tài)的調控，這些碳納米點的發(fā)光峰位可覆蓋藍光-近紅外區(qū)域，且熒光量子效率在全光譜區(qū)都可以超過10%[21,37]。碳納米點豐富的表面官能團決定其具有豐富的表面電子和空穴，在復合體系中可以作為電子給體或受體實現(xiàn)電荷轉移，發(fā)生熒光淬滅，這種特性也是碳納米點應用在生物傳感、催化等領域的基礎[38]。另外，碳納米點的長余輝發(fā)光、上轉化發(fā)光、多光子發(fā)光等光物理特性也是碳納米點在生物醫(yī)療應用的基礎[39-42]。

3 碳納米點診斷治療試劑

生物醫(yī)學成像是現(xiàn)代醫(yī)學中最高效準確的疾病診斷手段。碳納米點的光物理(吸收、發(fā)射)特性使得基于碳納米點的生物醫(yī)學成像成為可能。目前的研究已經(jīng)證明碳納米點作為高效熒光探針的應用潛力，并在體外細胞成像的基礎上發(fā)展到活體成像研究，在獲得生物信息的同時，為腫瘤等疾病的診斷提供了可能。除了傳統(tǒng)的熒光成像，碳納米點的近紅外吸收、光熱效應、光敏化特性使得其在光聲成像、光熱治療、光動力治療等新型成像和治療技術中得到了有效的應用。近年來，基于碳納米點的診斷、治療及一體化診療試劑已被有效開發(fā)并得到迅速發(fā)展。

Gao等人利用加熱碳化甘氨酸獲得了可選擇性聚集于腦膠質瘤C6細胞的碳納米點，并在活體實驗中實現(xiàn)了腦膠質瘤的非入侵式成像[43]。Sun等人隨后報道了以D-葡萄糖和L-天冬氨酸為原料熱解合成發(fā)光碳納米點CD-Asp。由于激發(fā)波長依賴的發(fā)射特性，CD-Asp可分別實現(xiàn)藍光、綠光和紅光區(qū)的發(fā)射。相對于正常細胞，CD-Asp對腦膠質瘤C6細胞具有自靶向特性，可自由穿過血腦屏障精確靶向到腦膠質瘤組織，通過活體成像實現(xiàn)腦癌診斷[44]。除了傳統(tǒng)的熒光成像，碳納米點光聲成像已被報道并應用于疾病早期診斷。Pan等人用以蜂蜜為原料用微波法制備了有機大分子表面鈍化的碳納米點(OCN)，并以其為造影劑實現(xiàn)了前哨淋巴結的快速光聲成像，即在前爪注射2 min后實現(xiàn)了51倍造影增強，可清晰的觀察到前哨淋巴結。這種碳納米點具有近紅外吸收、小尺寸(7 nm)、快速淋巴管傳輸和快速清除特性，應用于光聲成像技術，為外科手術實時快速發(fā)現(xiàn)并切除前哨淋巴結提供了簡便條件并有效降低成本(圖2)[45]。

圖2 左：動態(tài)光散射測定的OCN新配置水分散液的數(shù)均粒徑和滴涂在鎳網(wǎng)上的無水態(tài)OCN的TEM圖像。右：裸鼠前哨淋巴結的無損實時活體光聲成像：激發(fā)光652 nm。右上：OCN剛注射后(2 min)采集獲得的光聲圖像。右下：注射后210 min，圖像對比度嚴重減弱[45] Fig.2 Left: Number-averaged particle diameter from dynamic light scattering of as-synthesized OCN dispersed(0.2 M) in fresh water and anhydrous state TEM image drop-deposited on a nickel grid. Right: Non-invasive real-time in vivo PA imaging of SLN in a nude mouse: the laser was tuned to a wavelength of 650 nm. PA image acquired immediately (2 min) after the OCN injection(upper). The contrast is much weaker after 210 min post-injection(lower)[45]

圖3 在不同位置皮下注射GQDs后鼠明場(a)和紅光(b)成像。激發(fā)波長為502～540 nm，熒光采集通道為695～775 nm。(c)經(jīng)過各種處理后1天、9天、17天、25天鼠的照片。(PDT：GQDs+光照；C1：只注射GQDs；C2:只光照。)(d)經(jīng)過各種處理后時間依賴腫瘤生長曲線(n=5)，每組P<0.05[46](彩圖見電子版) Fig.3 (a)Bright-field image and (b)red-fluorescence image after subcutaneous injection of GQDs in different areas. The excitation wavelength was 502-540 nm, and the collected fluorescence channel was 695 775 nm. (c)Photographs of mice after various treatments on the 1st, 9th, 17th and 25th day(PDT:GQDs+light irradiation; C1:GQDs only; C2:light irradiation only.) (d)Time-dependent tumour growth curves(n=5) after different treatments. P<0.05 for each group[46](color figures are available in electro-version)

在通過成像性質進行疾病診斷同時，碳納米點在光動力、光熱治療等納米醫(yī)療技術中也得到了有效的應用。很多碳納米點診斷、治療一體化試劑已被報道。2014年，Wang等人報道了以聚噻吩衍生物為原料水熱法合成石墨烯量子點(GQD)，該石墨烯量子點具有紫外-可見-近紅外區(qū)寬吸收和深紅光發(fā)射(λmax=680 nm)，以及高單線態(tài)氧(1O2)產(chǎn)率(～1.3)，并作為成像和光動力治療一體化試劑進行了體外細胞和動物活體實驗，在白光照射下實現(xiàn)了小鼠皮下腫瘤的光動力治療(圖3)[46]。隨后，Wang等人以苯丙酸取代的噻吩聚合物為原料水熱法合成碳納米點，其吸收由可見延伸至近紅外區(qū)，發(fā)射峰位在640 nm，熒光量子效率2.3%。該碳納米點具有近紅外光熱轉換特性，在671 nm近紅外光激發(fā)下光熱轉換效率達到38.5%。由于具有紅光發(fā)射和近紅外光熱轉換特性，該碳納米點作為紅光成像、近紅外光聲成像和光熱治療一體化試劑應用于癌癥診斷和治療。在細胞和活體試驗中，靜脈注射碳納米點通過實體瘤的高通透性和滯留效應(EPR)聚集于腫瘤(HeLa tumor)部位，通過熒光和光聲成像可以實現(xiàn)碳納米點示蹤。注射8 h后，在671 nm激光照射(2 W/cm2)下實現(xiàn)了腫瘤的光熱治療，并未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用和生物體內毒性[47]。綜合上述工作，Wang等人后續(xù)以苯甲酸取代的噻吩聚合物為原料合成了可見-近紅外寬吸收和紅光發(fā)射的碳納米點。該碳納米點在635 nm激光照射下可同時產(chǎn)生1O2和熱能，1O2產(chǎn)率為27%，光熱轉換效率為36.2%，實現(xiàn)紅光激發(fā)下成像引導的光動力-光熱同步腫瘤診斷和治療[48]。由于碳納米點的主要吸收峰位于紫外-可見區(qū)，少數(shù)延伸至近紅外區(qū)，致使碳納米點在近紅外區(qū)的應用受到限制，由于近紅外光利用率低，碳納米點在光聲成像、光熱、光動力治療的實際應用中，多選取可見或600～700 nm的紅光-近紅外激發(fā)光，且光功率密度偏高(>2 W/cm2)，該條件在組織穿透深度、激光安全范圍以及光源來源方面都存在局限。針對這一問題，我們等利用尿素和檸檬酸通過水熱反應合成了表面電荷分布不均勻的小尺寸碳納米點CND，并通過可能的靜電相互作用和氫鍵形成超碳納米點組裝體supra-CND，在supra-CND中，相鄰CND通過空間交疊形成表面能級間電子躍遷，使得supra-CND在紅光-近紅外區(qū)產(chǎn)生強吸收峰(470～1 000 nm)，最大吸收峰位700 nm。supra-CND具有良好的近紅外光熱轉換性能，在732 nm處質量消光系數(shù)為18.61 g-1·cm-1，808 nm激光照射下光熱轉換效率達到53.2%。supra-CND具有良好的水溶性和低細胞毒性，是極具潛力的近紅外光熱治療試劑(圖4)[20]。Xie等人以花菁染料CyOH與PEG800為原料溶劑熱合成具有近紅外吸收和發(fā)射的水溶性碳納米點CyCD，光熱轉換效率為38.7%。CyCD可在HepG2細胞和CT26腫瘤荷瘤小鼠活體實現(xiàn)近紅外熒光成像以及CT26腫瘤近紅外光熱治療[49]。

圖4 (a)CNDs(左)和supra-CNDs(右)的溶液(上)和固體粉末(下)的光學照片；(b)CNDs和supra-CNDs的吸收光譜(紫外最大吸收處歸一化)；(c)不同濃度supra-CND水分散液在808 nm激光輻照(1 W/cm2)下與純水對照的光熱轉換曲線[20] Fig.4 (a)Optical images of CNDs(left) and supra-CNDs(right) in the solutions(upper) and the solid states(lower); (b)The absorption spectra (normalized at the absorption maxima in UV region) of CNDs and supra-CNDs; (c)Photothermal profile of supra-CND aqueous dispersions with different concentrations under 808 nm laser irradiation(1 W/cm2) in contrast to pure water[20]

除了腫瘤的成像和治療外，Qu等人通過在強酸中微波消解氧化石墨烯的方法獲得石墨烯量子點，并利用石墨烯量子點催化分解雙氧水生成具有更強抗菌活性的·OH，提高雙氧水的抗菌能力，有效降低雙氧水在傷口殺菌時所需濃度，并利用該石墨烯量子點制備了“邦迪”，在小鼠活體試驗中，在低濃度(100 μM)雙氧水輔助下實現(xiàn)了高效的傷口殺菌性能(圖5)[50]。

圖5 (a)基于GQDs和低含量H2O2抗菌系統(tǒng)的設計示意圖。(b)GQD創(chuàng)可貼應用于活體傷口殺菌[50] Fig.5 (a)The designed system based on GQDs and low level of H2O2 for the antibacterial application. (b)GQD Band-Aids used in wound disinfection in vivo[50]

綜上，根據(jù)碳納米點自身的結構及光物理性能，通過碳納米點多模式成像、自靶向、光敏化、光熱轉換等過程可實現(xiàn)碳納米點成像引導的腫瘤診斷和疾病治療，由于碳納米點良好的水溶性和生物相容性以及低制備成本，基于碳納米點的一體化診斷和治療試劑的設計和開發(fā)在納米醫(yī)療領域及其臨床推進中具有極大的發(fā)展?jié)摿脱芯績r值。

4 碳納米點復合物診斷治療試劑

碳納米點具有共軛平面以及羧基、氨基、羥基等豐富的表面官能團，可通過配位鍵、共價鍵、靜電相互作用或π堆積實現(xiàn)化學修飾，制備碳納米點復合物。復合物中各組分協(xié)同作用，可實現(xiàn)多模成像、載藥、靶向釋藥和光動力/光熱治療。

4.1 多模成像

現(xiàn)代醫(yī)學影像對疾病的早期、無創(chuàng)診斷至關重要，磁共振成像(MRI)、X射線斷層掃描、超聲成像、正電子發(fā)射計算機斷層顯像(PET)、熒光成像、光熱[51]、光聲成像[52-53]等技術各具優(yōu)缺點，由于熒光成像響應快、靈敏度高、具有亞細胞級分辨率，可與其它具有高組織穿透深度以及空間分辨率的成像手段結合實現(xiàn)多模成像。在多模成像探針中，磁共振(MR)/熒光探針在生物醫(yī)學研究中發(fā)展的最為成熟。碳納米點在生物熒光成像中的應用已被廣泛研究，利用碳納米點與MRI造影劑復合，進行MR/熒光多模成像，可實現(xiàn)疾病的精確診斷。

圖6 (A)細胞毒性和靶向性。(a)Gd@C-dots在不同PH值緩沖溶液中放置的光致發(fā)光強度變化。(b)Gd@C-dots隨時間變化的Gd釋放量。(c)MTT法測定U87MG細胞活性。(d)細胞靶向研究。(e)細胞顆粒T1-加權MR成像,細胞與RGD-Gd@C-dots或Gd@C-dots共孵育。(B)(a)T1-加權斷面MR成像，成像時間0, 10, 30, 45, 60 and 240 min。(b)T1-加權冠狀MR成像。動物腫瘤注射RGD@Gd-dots后信號明顯增強。(c)b中成像結果不同時間點信號變化。(d)腫瘤樣品的免疫熒光組織學研究[52] Fig.6 (A)Cytotoxicity and cell targeting. (a)Photoluminescence intensity change when Gd@C-dots were incubated in buffers of different pH values. (b)Gd release from Gd@C-dots over time. (c)Cell viability, evaluated by MTT assays with U87MG cells. (d)Cell targeting study. (e)T1-weighted MR images of cell pellets, where cells had been incubated with either RGD-Gd@C-dots or Gd@C-dots. (B) (a) T1-weighted transverse MR images. Images were acquired at 0, 10, 30, 45, 60 and 240 min. (b)T1-weighted coronal MR images. Significant signal enhancement was observed in tumors of animals injected with RGD@Gd-dots. (c)Relative signal change at different time points, based imaging results from b. (d)Immunofluorescence histology study with tumor samples[52]

4.2 基因傳遞與藥物輸運

基因治療在遺傳性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤的治療中具有重要的應用前景[61-62]。對于核酸傳遞，由于病毒載體的安全隱患和規(guī)模生產(chǎn)限制，非病毒基因載體被廣泛開發(fā)。碳納米點可以與核酸通過靜電作用形成復合物，實現(xiàn)基因傳遞[63-67]。Liu等人利用甘油和枝化聚乙烯亞胺(bPEI)通過微波熱解法合成了PEI表面鈍化的碳納米點。通過優(yōu)化微波時間，獲得具有低毒性和激發(fā)波長依賴特性的多色發(fā)光的碳納米點-PEI(CD-PEI)復合物，與“黃金標準”非病毒載體PEI25k相比，CD-PEI在COS-7和HepG2細胞中表現(xiàn)出高于或與PEI25k相當?shù)慕閷DNA轉染能力，同時實現(xiàn)熒光成像[64]。Kim等人利用PEI修飾的碳納米點(CD-PEI)、PEI修飾的金納米粒子(Au-PEI)和pRNA通過靜電相互作用構筑了三元納米組裝體(CD-PEI/Au-PEI/pDNA)。根據(jù)Au-PEI與CD-PEI空間距離的變化帶來的動態(tài)熒光淬滅和恢復，CD熒光強度的變化可以反應出組裝體的形成和解離過程。細胞實驗證明CD-PEI/Au-PEI/pDNA具有低毒性和高DNA轉染能力，并可以通過熒光研究實時監(jiān)控組裝體形成/解離和轉染過程，免去了對pDNA的熒光標記(圖7)[65]。Wu等人通過氧化bPEI和水熱反應合成了高熒光量子效率(54.3%)的碳納米點PCD，PCD具有熒光標記特性、高生物相容性和基因傳遞能力[66]。Lebeau等人以檸檬酸和bPEI為原料微波合成碳納米點(CD)，并對CD在不同pH下透析進行精細提純。CD可有效地結合pDNA和siRNA，在活體實驗中通過非入侵式的肺部給藥實現(xiàn)與GL67A相當?shù)母咝Х尾緿NA輸運，并且毒性更低[67]。作為非病毒載體，以PEI為碳源或表面鈍化劑的碳納米點可通過靜電相互作用有效地結合核酸，實現(xiàn)與PEI25k相當?shù)幕騻鬟f能力并降低載體的毒性。碳納米點作為基因載體既可實現(xiàn)外源基因體外細胞轉染，又可以實現(xiàn)活體基因傳遞，為基因治療提供有潛力的非病毒載體。

圖7 利用CD-PEI/Au-PEI/pDNA分子組裝納米雜化材料進行基因傳遞及細胞轉運實時監(jiān)測示意圖[65] Fig.7 A schematic illustration for the gene delivery and real-time monitoring of cellular trafficking utilizing CD-PEI/Au-PEI/pDNA molecular assembly of nanohybrids[65]

化學藥物輸運在靶向給藥以及藥物緩釋的研究中具有重要意義。碳納米點具有π共軛核結構和豐富的表面官能團，可以與藥物分子和其它組裝單元相互作用，實現(xiàn)載藥、可控釋藥和診斷治療，降低藥物副作用，提高腫瘤抑制效果[27,68-71]。Singh等人將微波合成的碳納米點與喹啉-苯丁酸氮芥共聚物通過共價復合形成了光響應納米藥物輸運系統(tǒng)。依賴碳納米點的發(fā)光特性，該復合物具有激發(fā)波長依賴的熒光發(fā)射(325～550 nm)，可進入HeLa細胞的細胞質和細胞核中實現(xiàn)熒光成像。喹啉作為光觸發(fā)劑可實現(xiàn)抗癌藥苯丁酸氮芥在HeLa細胞內的單光子/雙光子光控釋放，高效地殺死癌細胞[68]。Zhou等人將碳納米點包埋于聚合物poly(NIPAM-AAm)中制備納米凝膠，并與抗癌藥姜黃素復合，熒光碳納米點復合物可進入B16F10癌細胞中實現(xiàn)成像，通過納米凝膠熱敏體積相轉變引起的碳納米點熒光強度改變實現(xiàn)環(huán)境溫度光學傳感。碳納米點光熱轉換特性可實現(xiàn)姜黃素近紅外光控釋放，增強對B16F10細胞毒性[69]。Wang等人將綠光發(fā)射的碳納米點與分子篩咪唑酯骨架化合物(ZIF-8)納米晶復合，利用ZIF-8的孔結構負載抗癌藥5-氟尿嘧啶，在HeLa細胞中同時實現(xiàn)成像和PH控制釋藥[70]。Sun等人通過熱解檸檬酸和多烯多胺合成發(fā)光碳納米點，并將碳納米點與奧沙利鉑氧化前體(Oxa(IV)-COOH)共價接枝形成復合物CD-Oxa實現(xiàn)藥物負載。復合物在HepG2細胞和荷載肝癌(H22)小鼠活體中可實現(xiàn)激發(fā)波長依賴的熒光成像。CD-Oxa在瘤內注射后可通過活體熒光成像監(jiān)控鉑藥的體內分布從而控制給藥時間和劑量，實現(xiàn)個體化治療。癌細胞內環(huán)境可將Oxa(IV)-COOH還原為oxaliplatin(II)實現(xiàn)癌細胞內靶向釋藥(圖8)[27]。

圖8 CD-Oxa合成及其在生物成像和診斷治療中的應用示意圖[27] Fig.8 Synthetic scheme for CD-Oxa and its applications in bioimaging and theranostics[27]

碳納米點負載抗癌藥阿霉素(DOX)也被廣泛報道[72-78]。Qu等人通過高溫熱解EDTA-2Na·2H2O制備表面負電性的發(fā)光碳納米點，與表面正電修飾的介孔硅納米粒子通過靜電相互作用復合，將DOX包封負載于介孔硅納米粒子中。納米復合物可通過內吞作用進入HeLa細胞溶酶體，在Hela細胞中和裸鼠皮下實現(xiàn)熒光成像。負載阿霉素的復合物在溶酶體的酸性條件下解離，在細胞內釋藥，提高藥物細胞毒性[73]。Sharon等人以山梨醇為原料微波下合成綠光發(fā)射碳納米點，與牛血清蛋白(BSA)、葉酸(FA)復合并負載DOX(負載率86%)，靶向進入癌細胞(HeLa細胞)并成像，在中性以及微酸性環(huán)境下釋藥[74]。Guo等人利用氧化石墨烯photo-Fenton反應制備石墨烯量子點(GQD)，并通過π-π相互作用與DOX形成復合物。GQD實現(xiàn)載藥性能的同時可以提高DOX的DNA裂解活性和細胞核內聚集能力。相比于DOX，DOX/GQD復合物提高了對于具有DOX抗藥性的MCF-7/ADR細胞的細胞毒性[75]。Chang等人利用苯硼酸改性的MnFe2O4與碳納米點復合，以苯硼酸為靶向配體，復合物可在HeLa細胞中實現(xiàn)T2加權MRI和熒光雙模成像。復合物中碳納米點通過π-π相互作用負載DOX，并通過PH控制細胞內釋藥[76]。我們利用微波法合成表面富羧基的綠光發(fā)射碳納米點并通過非共價吸附實現(xiàn)DOX負載。基于癌細胞與正常細胞pH環(huán)境的差別，使藥物對癌細胞實現(xiàn)選擇性釋放，以肝癌(HepG2)腫瘤為模型實現(xiàn)裸鼠活體成像和腫瘤抑制(圖9)[77]。

圖9 實驗設計示意圖。(a)DOX上的胺基(-NH2)與CDs上的羧酸基團(-COOH)通過靜電相互作用和氫鍵結合；(b)CD-DOX復合物傳遞至HepG2癌細胞和HL-7702正常細胞并伴隨強綠光信號示蹤。因為癌細胞內PH值低，CD-DOX復合物可將DOX釋放至HepG2癌細胞，但不會釋放到HL-7702正常細胞。基于GQD的FRET細胞核靶向傳遞系統(tǒng)實時監(jiān)控藥物釋放過程的示意圖[77] Fig.9 Schematic illustration of the experimental design overview. (a)The amines(-NH2) on DOX bind with the carboxylic acid(-COOH) on CDs via electrostatic interactions or hydrogen bonding. (b)Delivery of CD DOX conjugates to HepG2 cancer cells and HL-7702 normal cells with strong green signal imaging tracking. The CD DOX conjugates are expected to release DOX in HepG2 cancer cells, but not HL-7702 normal liver cells, due to low pH in cancer cells.Schematic illustration of the GQD-based FRET system for nuclear-targeted delivery allowing for real-time monitoring the drug release process[77]

Dong等人利用酸堿中和放熱在短時間內(6 min)合成了磷、氮共摻雜中空結構綠光發(fā)射碳納米點，與DOX形成復合物，在HepG2細胞和荷瘤小鼠活體中成像和釋藥，抑制腫瘤[78]。Cui等人將表面PEG化的石墨烯量子點與細胞穿膜肽TAT偶聯(lián)，作為藥物載體與DOX復合，同時碳納米點作為給體與DOX構成熒光共振能量轉移(FRET)復合物。在體外細胞(HeLa)試驗中，TAT肽可靶向核孔復合物，有助于藥物的核內輸運。FRET信號可反應給受體間的距離，在通過給受體的熒光變化可以實時監(jiān)控藥物釋放情況[79]。Xu等人以阿司匹林為原料，采用“一步法”微波輔助合成具有雙功能性的碳納米點。該碳納米點不但有良好的熒光穩(wěn)定性，而且能夠進入人頭頸癌細胞及小鼠單核巨噬細胞。結構分析表明該碳納米點含有阿司匹林官能團。通過建立大鼠體內急性炎癥動物模型，H&E(hematoxylin-eosin staining)染色、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)等方法檢測結果表明所制備的碳納米點具有良好的抗炎作用。體外脂多糖 (LPS)與RAW264.7細胞共培養(yǎng)誘導炎癥環(huán)境，Real-time PCR檢測炎癥因子表達，發(fā)現(xiàn)在一定濃度時，合成的碳納米點能降低TNF-α和IL-1β的表達水平，且優(yōu)于阿司匹林的抗炎作用[80]。

4.3 光動力/光熱治療

光動力治療(PDT)通過光敏劑將光能傳遞給周圍氧產(chǎn)生活性氧簇殺死細胞或破壞腫瘤組織實現(xiàn)局部疾病治療[81]。碳納米點除了用作光動力治療的光敏劑外，還可以負載光敏藥物形成多功能復合物用于診斷和光動力治療。Chen等人將NH2-PEG鈍化的綠光發(fā)射碳納米點與二氫卟吩e6(Ce6)共價偶聯(lián)形成復合物C-dots-Ce6，碳納米點的發(fā)射光譜與Ce6的吸收光譜重疊，通過FRET能量轉移，430 nm激發(fā)下Ce6的熒光強度提高35倍。C-dots-Ce6可標記MGC803細胞質實現(xiàn)紅光成像，并通過在MGC803腫瘤荷瘤小鼠體內活體成像實現(xiàn)藥物示蹤。C-dots-Ce6的尺寸效應延長了藥物血液循環(huán)半衰期并通過被動靶向在腫瘤組織富集。細胞毒性試驗證明碳納米點的復合可以提高Ce6的單線態(tài)氧(SO)產(chǎn)率，并在動物活體試驗中通過PDT作用有效抑制腫瘤增長[82]。Hahn等人將碳納米點-Ce6復合物與透明質酸(HA)偶聯(lián)，通過HA的靶向作用穿皮給藥實現(xiàn)對黑色素瘤的成像及高效光動力治療[83]。Chen等人通過水熱法合成表面帶負電的藍光發(fā)射碳納米點，并通過靜電相互作用與帶正電的卟啉化合物5,10,15,20-tetrakis(1-methyl 4-pyridinio) porphyrins (TMPyP)復合，碳納米點的發(fā)射帶隙與TMPyP的吸收帶隙重合，F(xiàn)RET能量轉移效率為45%。700 nm處碳納米點雙光子吸收截面(TPACS)為15 000 GM。基于高TPACS和FRET效率，700 nm飛秒激光激發(fā)下，復合物在HeLa細胞中實現(xiàn)雙光子成像，SO產(chǎn)率高于單獨使用光敏劑TMPyP。在細胞PDT試驗中，以復合物為光敏劑，在700 nm、160 mW/mm2飛秒激光照射下，45 min后HeLa細胞的存活率低于20%，復合物可實現(xiàn)在低功率密度照射下的高效雙光子PDT治療[84]。Wei等人將石墨烯量子點與光敏劑Hypocrellin A通過π-π相互作用復合，包覆于多孔SiO2中。碳納米點用于載藥和多色熒光成像，在可見光激發(fā)下排除組織自發(fā)熒光的干擾；Hypocrellin A作為可見光激發(fā)的高效光敏劑光動力治療淺表性疾病和腫瘤；多孔SiO2在提高成像和PDT效果的同時防止輸運過程中復合物的解離。復合物在HeLa細胞的細胞質中實現(xiàn)了多色成像，以及可見光激發(fā)下的光動力治療[85]。Kim等人通過環(huán)糊精碳化、PEG-NH2表面鈍化以及葉酸(FA)表面修飾獲得了具有腫瘤靶向特性的藍光發(fā)射碳納米點(CD-PEG-FA)。CD-PEG-FA通過π-π相互作用復合光敏劑酞菁鋅(ZnPc)，復合物通過靶向作用進入葉酸受體高表達細胞系中，在HeLa細胞和HeLa腫瘤荷瘤小鼠體內實現(xiàn)細胞成像，并通過輸運ZnPc實現(xiàn)腫瘤光動力治療(圖10)[86]。

圖10 通過α-環(huán)糊精制備碳納米點(CD)以及利用葉酸修飾碳納米點負載酞菁鋅(CD-PEG-FA/ZnPc)進行靶向光動力治療的示意圖[86] Fig.10 Schematic illustration of the preparation of carbon nanodots(CD) from α-cyclodextrin and targeted photodynamic therapy with folic acid functionalized carbon nanodots loaded with zinc phthalocyanine(CD-PEG-FA/ZnPc)[86]

光熱治療通過光熱轉換試劑將外部光源的能量轉換為熱量引起組織局部溫度提高進而殺死細胞[87]，碳納米點的近紅外吸收可以使其用作光熱轉換試劑，同時，碳納米點可以負載其它類型光熱轉換試劑以及化學藥物實現(xiàn)多種治療手段協(xié)同作用的疾病治療。Zhou等人將發(fā)光碳納米點包埋于多孔碳納米膠囊中構筑尺寸100 nm左右的復合物FPC-NC，可在DU145細胞質中實現(xiàn)雙光子熒光成像。FPC-NC的多孔結構有利于負載抗癌藥，且具有近紅外光熱轉換特性，在DU145細胞中，負載DOX的FPC-NC可通過PH調控和近紅外光熱轉換引發(fā)釋藥，F(xiàn)PC-NC-DOX復合物在近紅外光源照射下可以實現(xiàn)光熱治療和化療的協(xié)同作用殺死DU145細胞(圖11)[88]。Sharon等人通過微波熱解阿拉伯膠(GA)制備發(fā)光碳納米點，并利用碳納米點修飾金納米棒(GNR)表面，得到低細胞毒性的碳納米點-金納米棒復合物(C-dots@GNR)。復合物負載抗癌藥DOX，由于碳納米點的多孔結構，載藥量達到94%，碳納米點的熒光特性實現(xiàn)對藥物的熒光標記。在細胞試驗中，復合物通過表面正電實現(xiàn)細胞內吞，在近紅外光照射下，其中GNR的光熱轉換特性可同時實現(xiàn)加速釋藥和光熱治療[89]。

圖11 (a)多功能FPC-NCs示意圖。嵌入多孔碳殼的發(fā)光碳納米點不僅能夠作為共聚焦和雙光子成像造影劑,也能有效地將近紅外光轉換成熱。同時,大的中空腔和多孔碳殼可以通過FMC-NCs與DOX之間的超分子π堆積、氫鍵、和靜電相互作用大量負載抗癌藥(DOX)。因此，F(xiàn)PC-NCs可以將光熱/化療整合成一個納米體系從而實現(xiàn)更高的療效；(b)負載DOX的FPC-NCs化療和近紅外光照下光熱/化學合并治療示意圖[89] Fig.11 (a)Schematic illustration of multifunctional FPC-NCs. The fluorescent CDs embedded in the porous carbon shell can not only be used for confocal and two-photon imaging contrast, but also convert the NIR light to heat effectively. In addition, the large hollow cavity and porous carbon shell can provide a high loading capacity for anti-cancer drug(DOX) through the supramolecular π stacking, hydrogen bonding, and electrostatic interactions between DOX and FMC-NCs. Thus, the FPC-NCs can combine photothermal/chemotherapy into a single nano-object to provide high therapeutic efficacy; (b)Schematic illustration of the chemotherapy and combined chemo-photothermal treatment of the DOX-loaded FPC-NCs in the presence of NIR irradiation[89]

5 碳納米點生物毒性

相比于傳統(tǒng)的量子點，碳納米點由于其碳基組成而具有本源的生物相容性。碳納米點在細胞和活體成像以及治療方面的實驗證明碳納米點對細胞、植物和動物的生存能力無明顯影響。然而，基于碳納米點自身的結構和組成單元，其在生物體內的長期毒理和藥物代謝動力學仍需深入研究。

Sun等人研究了PEG表面鈍化的碳納米點生物毒性，證明了碳納米點對MCF-7和HT-29細胞系的增殖、存活率等無明顯影響。在CD-1鼠活體試驗中，給藥動物的臨床癥狀、血液生物分析和組織學分析均可證明高于活體成像劑量的碳納米點對模型鼠無明顯生物毒性。此類碳納米點在給藥6 h后在肝臟和脾臟有少量富集[90]。Liu等人證明了通過氧化碳納米管和石墨烯獲得的碳納米點在高濃度時對293T細胞生長和小鼠活體無毒[91]。Cui等人通過急性毒性、亞急性毒性、基因毒性試驗證明了通過硝酸氧化法制備的碳納米點對試驗鼠無毒[92]。Chen等人通過單次和多次給藥和小鼠血液學、血液生化指標、組織病理學等檢驗證明了基于檸檬酸合成的碳納米點在90天實驗期對鼠體低毒，其對雌鼠和雄鼠的半數(shù)致死量(LD50)分別為391.615 mg/kg和357.771 mg/kg[93]。Dhara和Liu等人分別研究了碳納米點的血液相容性[94-95]。Liu等人證明了水熱碳化α-環(huán)糊精獲得的碳納米點在濃度低于0.1 mg/mL時對血液成分基本無不利影響；碳納米點靜脈注射量在50 mg/kg以內時對鼠體的凝血功能無明顯影響[95]。Xu等人通過體外和體內實驗，對以阿司匹林制備的碳納米點的毒性進行了研究，結果表明在生物應用濃度范圍內，合成的碳納米點細胞毒性較小，對細胞及心、肝、脾、腎等臟器影響不明顯[80]。

圖12 (a)不同方法給藥后C-dot-ZW800的尿富集。小鼠在異氟烷麻醉下，膀胱部位曝光，近紅外成像圖像在靜脈(上)、肌肉(中)、皮下(下)注射前、后如圖中標識的時間點獲取。(b)(a)中ZW800熒光信號數(shù)值。(c)64Cu-C-dot經(jīng)3種給藥方式：左，靜脈注射；中，肌肉注射；右，皮下注射后通過1h動態(tài)PET成像獲得的代表性冠狀位圖像。(d)C-dot-ZW800經(jīng)不同方式給藥后的腫瘤富集情況[96] Fig.12 (a)Urine accumulation of C-dot-ZW800 after different routes of injection. The mice were kept under isoflurane anesthesia, the bladder was exposed, and NIR images were acquired at the indicated time points before and after (top) iv injection, (middle) sc injection, and (bottom) im injection. (b)Quantification of the ZW800 fluorescence signal in (a). (c)Representative coronal images from 1 h dynamic PET imaging of 64Cu-C-dot after three routes of injection: left, iv injection; middle, sc injection; right, im injection. (d)Tumor uptake of C-dot-ZW800 after different routes of injection[96]

Chen等人通過近紅外熒光成像和正電子發(fā)射計算機斷層掃描(PET)成像研究PEG表面鈍化的碳納米點在不同給藥方式(靜脈、肌肉、皮下注射)下在小鼠體內分布、代謝情況，并發(fā)現(xiàn)3種給藥方式進入動物體內的碳納米點均可快速的通過腎臟代謝隨尿液排出體外；此外，碳納米點可通過被動靶向作用進入荷瘤小鼠腫瘤部位(圖12)[96]。根據(jù)已有的報道，盡管不同組成和結構的碳納米點在生物體內的毒理及代謝機制不同，但是碳納米點的基本碳基組成和尺寸效應保證了碳納米點具有較高的生物相容性，這為碳納米點的臨床推進研究提供了基礎。

6 結論與展望

碳納米點的組成、結構和物理化學特性使得其在碳納米管和氧化石墨烯之后成為極具生物醫(yī)用前景的新興碳納米材料。碳納米點原料來源廣泛，合成方法簡單多樣，表面官能團豐富，可以與靶向配體、醫(yī)學影像造影劑、核酸、化學藥物、光敏劑、光熱轉換試劑等功能性診斷治療試劑相互作用形成復合物。現(xiàn)有的研究結果證明碳納米點除了自身的發(fā)光、自靶向、光敏化、光熱轉換等特性可作為診斷治療試劑應用于納米醫(yī)療領域外，其與特定功能材料形成的復合物在醫(yī)學影像、基因及藥物輸運、腫瘤治療的應用中具有獨特的優(yōu)勢。具有診斷治療功能的碳納米點及其復合物的研究在推進疾病的個體化、可視化、非入侵式、小損傷、靶向治療中展現(xiàn)了良好的發(fā)展前景。

相比于傳統(tǒng)無機量子點，碳納米點的碳基組成具有更高的生物相容性。作為納米材料，碳納米點的結構和組成單元帶來的長期毒性和藥物代謝動力學是決定其實現(xiàn)臨床應用的關鍵，已有的動物模型生理指標數(shù)據(jù)和循環(huán)代謝結果證明了碳納米點的低毒性，然而由于碳納米點的組成、結構的多樣性和活潑的表面特性，碳納米點在生物體內的作用機制、毒理研究及臨床推進仍是碳納米點應用于生物醫(yī)療領域的研究重點。

綜上，研究并明確碳納米點的結構和發(fā)光機制，實現(xiàn)碳納米點的結構設計和可控發(fā)光，逐步開發(fā)具有高生物相容性和可精確修飾的碳納米點及其復合物，進而在細胞水平上獲得基于碳納米點的熒光成像試劑實現(xiàn)高分辨/超分辨亞細胞級成像，研究生命過程，通過復合修飾獲得基因、化學藥物、光熱/光動力治療試劑是目前碳納米點研究的重要課題。在此基礎上，將碳納米點功能性復合試劑進一步推廣到活體成像、診斷和治療，明確碳納米點及其復合藥物在生物體內的毒理特性和代謝動力學，最終推進并實現(xiàn)基于碳納米點的試劑及藥物的臨床應用。將碳基納米材料與納米醫(yī)學技術從研發(fā)推向應用，克服已有的有機熒光染料、小分子藥物、無機納米粒子面臨的問題，為人類重大疾病診斷治療提供新型材料和方法，是碳納米點研究的重要方向和目標。

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