微流控SERS芯片及其生物傳感應用

王志樂，王著元，宗慎飛，崔一平

(東南大學 先進光子學中心，江蘇 南京 210096)

1 引 言

微流芯片誕生時可能只是作為納米技術革命的過渡，而由于材料科學、加工工藝的快速發展，微流控技術也有了突破性的進展。微流控系統也被稱為“芯片實驗室”(lab on a chip，LoC)[1]，具有樣品消耗量低、反應時間短、嚴格操控及便攜性等優勢。隨著微流控技術的進一步發展，研究者們不再滿足于只將化學反應搬到芯片中，而是把各種分析物的檢測也放在微流中進行。微量樣品的檢測必然需要高靈敏度的檢測方法，于是微流芯片作為一個良好的平臺應用于很多檢測技術，這使得諸如光學、生物、醫學等領域的研究者都對其產生了濃厚的興趣[2]。

近年來，光學與光譜學技術發展成為了一種高靈敏、快速、高效并且無損的檢測成像手段[3]，其中表面增強拉曼光譜(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是最常用的光譜方法之一。SERS光譜具有諸多優點，例如可作為分子的指紋光譜進行無標檢測[4]，其超高的靈敏度可以實現單分子檢測[5]，窄峰寬可實現多元檢測[6]等，在生物傳感上有著廣泛的應用。最近，將SERS技術與微流芯片相結合形成的微流控SERS檢測芯片(SERS-LoC)成為新的研究趨勢：SERS可以檢測在微流通道內超低濃度的樣品，而微流芯片的多通道設計可以方便的實現多元SERS檢測[7]。SERS可以為微流平臺提供優秀的檢測技術。而通過微流通道制作SERS基底可以解決在溶液中檢測時SERS信號無規律波動的問題，從而大幅度提高SERS檢測的重復性與可靠性。不僅如此，微流控芯片良好的可操作性也被很多研究者用來控制合成不同形貌的基底以及實現多功能[8]。SERS與微流芯片的結合為兩種技術的發展都提供了很多新的機遇，而且二者互補也解決了各自的問題，為多功能的SERS-LoC系統打下堅實的基礎，在生物、化學檢測，醫學診斷等領域都有很大的發展空間[9]。

鑒于SERS-LoC近年來取得的突出研究進展，本文在簡要介紹SERS的機理及最近的發展的基礎上，重點概述了SERS在生物傳感領域中的典型應用，最后討論了SERS微流控芯片技術及在生物檢測中的應用前景及發展方向。

2 SERS原理及發展

自被發現以來，拉曼散射一直倍受關注[10]。拉曼光譜與分子振動能級相關，可以提供每種分子獨一無二的“指紋”信息。這使得拉曼光譜在研究物質成份時十分方便有效。同為振動光譜的紅外光譜(IR)技術在材料分析等領域也有廣泛應用，然而水有著很強的紅外吸收，容易產生較強的背景。相反地，水的拉曼散射信號非常弱，不會對樣品的信號產生顯著干擾。因此，在分析水溶液樣品時，拉曼光譜相比紅外光譜更有優勢。然而，物質的拉曼散射信號強度通常較低，導致拉曼散射光譜技術的靈敏度不高。尤其對于低濃度的痕量樣品來說，拉曼散射信號甚至會無法探測到。幸運的是，1974年Fleischmann首次發現粗糙金屬表面可以極大地增強拉曼散射，增強倍數可達103～104。這一異常增強現象被稱為SERS效應。SERS發現對拉曼光譜的發展產生了深遠的影響和有力的推動[11]。其后，人們對SERS效應中金屬(特別是貴金屬)增強拉曼散射信號的原理進行了深入的研究，目前人們廣泛認可的增強機制為長程電磁增強(electromagnetic enhancement,EE)和短程化學增強(chemical enhancement,CE)的協同作用[12]。

金屬粒子增強局部電磁場強的能力主要來自于其等離激元(plasmon)的性質。等離激元為金屬的自由電子的振蕩。等離激元可分為發生在宏觀表面的表面等離激元極子(surface plasmon polaritons,SPP)和發生在納米結構中的局域表面等離激元(localized surface plasmons,LSP)。圖1(a)可以顯示出這一過程。振蕩的電子云與電磁場矢量相反方向運動，在入射光激發下金屬納米粒子會產生自己的偶極子場來增強局域光場。當入射光接近局域表面等離子體共振(LSPR)頻率時場增強效果會變得更好。當增強的入射光激發附近的拉曼分子時，散射出來的場又會被金屬納米粒子增強(圖1(c)～1(d))。于是有了SERS增強的經典公式：

(1)

式中，Eloc為局域場的振幅，E0為入射場的振幅，εm為金屬納米粒子的介電常數，εs為環境的介電常數(圖1(b))。由公式(1)也可推斷出最理想的增強金屬為銅、銀和金，因為這些金屬不僅吸光度低，并且可以在光學頻率上支持局域表面等離子體共振。處在電磁場的納米結構在其尖端或邊緣增強因子最強，可達到1010數量級。如果將拉曼分子置于納米粒子表面的這些位置，可以得到非常可觀的SERS信號。

圖1 (a)電子云振蕩的圖示，對于小于光波長的納米粒子而言其電子云振蕩方向與電場矢量方向相反;(b)描繪正文中公式1的參數;(c)在光激發下金屬納米粒子發射的偶極子場;(d)入射場和出射場的電磁增強 Fig.1 (a)Illustration of the oscillating electron cloud, which moves in opposite direction of the electric field vector, for a nanoparticle smaller than the wavelength of light; (b)depiction of the parameters used in eq 1 of the main text; (c)emitted dipole field of a metallic nanoparticle under light excitation; (d)EE of both the incident field and the scattered field

相對電磁增強而言，化學增強是一種非常短程的效應，只影響到吸附在金屬表面或者幾埃(?)范圍內的拉曼分子，而且增強因子通常也比較小，只有101～102。化學增強的機制產生于一個自由分子被金屬表面吸引時電子結構的改變，有4種過程可以產生這種化學增強：吸附在金屬表面分子極化度的增加；分子-金屬復合物的電子轉移共振；共振散射的增強以及等離子體共振的增強。這4種過程互相關聯，很難單獨量化每一個成分對化學增強總體的貢獻。

于是SERS信號強度的增強因子(EF)可以由電磁增強(EE)和化學增強(CE)相乘得到(EF=EE×CE)。而這兩種增強因子較難量化，因此一般利用以下公式計算增強因子：

(2)

式中，ISERS和IRFM分別表示待測物的SERS信號強度和未經增強的拉曼散射信號強度，Nsurface和Nbulk分別表示SERS和拉曼散射檢測中被激發待測分子數。有關SERS的報道中，增強因子從107～1015不等。在實際研究中拉曼分子的SERS增強效果會被很多因素影響，例如分子-金屬的相互作用、激發光以及SERS基底。

對于金屬表面的拉曼分子而言，分子取向會影響SERS光譜。如果局域電場的極化與金屬表面垂直，則吸附分子的拉曼模式中垂直于表面的極化張量被選擇性增強。這一選擇性增強造成的結果是，不同濃度下SERS光譜中有新的峰出現或有的峰消失，尤其是被測拉曼分子中有很多不同的官能團時這一現象更容易出現。這種現象最早由表面選擇規則(Surface Selection Rules,SSR)描述[13]。高度對稱的分子散射主要取決于與對稱相關的選擇性規則，如中心對稱的分子吸附到金屬表面時其對稱性被破壞而使不同的峰被增強。

對于激光的影響，主要是當激發等離子激元的激光頻率與分子能量相當時會產生表面增強共振拉曼散射(SERRS)，拉曼信號會得到極大的增強[14]。雖然等離子激元共振頻率很難精確的匹配分子的電子轉移頻率，但在實際研究中發現，即使二者相差250 nm左右時依然可以激發SERRS。與SERS相比，SERRS中的增強因子會有由共振引起的額外的增強效應，但SERRS所得到的強度很大程度上依賴于激發波長。

值得注意的是，SERS基底對SERS信號的影響十分顯著，因此SERS基底是很多研究的重點[15]。由于金、銀等貴金屬的SERS增強效果最佳，一般的SERS研究都以金、銀或其合金作為基底。在SERS基底中，能提供拉曼增強的區域被稱為熱點(hot spot)，主要為納米粒子的聚集處。熱點處的電場被極大地增強，從而產生顯著的拉曼增強。至今，研究者們已經提出了各種各樣的SERS基底，而這些基底中必不可少的就是為SERS增強做主要貢獻的熱點區。Song等人[16]的綜述文章中將熱點的發展分為三代。

第一代SERS基底為簡單的納米粒子結構，如圖2(a)～2(c)。這類SERS基底通常是具有特殊幾何形貌的金屬納米粒子，他們的尖角或邊緣等處可形成有效的熱點。因此雖然結構簡單，也可以獲得較大的拉曼增強效果。典型的代表有，球形金納米顆粒[17]、球形銀納米顆粒[18]、棒狀金納米顆粒[19]、星形金納米顆粒[20]、三角形銀納米顆粒等[21]。我們課題組也制備出了多種SERS基底，例如金納米星[22]、金納米團簇[23]、銀納米棱鏡[24]等(圖2(d)～2(f))。

圖2 (a)金納米粒子的TEM圖；(b)銀納米粒子的TEM圖；(c)鹽酸處理過的金納米棒的TEM圖；(d)金納米星的TEM圖；(e)4MBA標記的金團聚體的TEM圖；(f)銀納米棱鏡的TEM圖 Fig.2 TEM image of (a)AuNPs; (b)AgNPs; (c) HCl-treated GNRs; (d)gold nanostars; (e)4MBA-labeled Au aggregates; (f)Ag nanoprisms

第二代SERS基底為納米粒子組裝體，通過組裝體內粒子間的電磁場耦合作用產生熱點以達到SERS增強的效果。圖3是典型的多聚體[25]、納米衛星[26]的TEM照片。制備這種納米組裝體時，通常需要精密的設計。例如，可通過靜電作用、DNA或小分子等進行納米顆粒的組裝，并對組裝實驗進行優化以保證一定的產率。得益于豐富的熱點，利用這類納米粒子組裝體作為SERS基底時，獲得的SERS信號強度能比第一代SERS基底高2～4個數量級。

圖3 (a)L形納米三聚體的TEM圖，在二氧化硅殼內包裹三個修飾PCEPE的金核；(b)3D自組裝等離子體超結構的TEM圖，在硅殼內包裹80納米金核和眾多單分散的20納米金納米衛星粒子 Fig.3 (a)TEM image of an L-shaped trimer nanoantenna comprised of three Au cores functionalized with PCEPE (structure shown) and encapsulated in a SiO2 shell; (b)TEM images of 3D self-assembled plasmonic superstructure comprising a silica-encapsulated 80 nm Au core and multiple monodisperse 20 nm Au satellite particles

第三代SERS基底指有序的陣列基底，它們可以提供更均勻的SERS增強效果。從整體上看，前兩代SERS基底具有較隨機的結構，即便是同批制備的基底(例如金納米星)，彼此之間的SERS增強因子差別仍可能較大，使得SERS信號的均一性不佳。第三代有序陣列SERS基底在第一、二代基底的基礎上，將第一、二代SERS基底與硅、PDMS等基質材料結合，制作均勻的陣列結構。例如，使第一代或第二代基底在硅襯底上以一定的規律排布，即可獲得按規律排列的熱點陣列。如圖4，經典的第三代SERS基底有納米天線陣列[27]、納米柱陣列[28]、SHINERS陣列[29]、納米球平板印刷(NSL)陣列[30]等。這些陣列基底的制備大多采用物理方法，利用高度發達的納米工藝對材料的形貌實現精密的控制。規則的陣列可以使SERS熱點排布更加均勻，測得的信號也具有良好的可重復性及可靠性。SERS基底制備工藝的發展對推進SERS的應用起到了關鍵作用。正是由于SERS基底有著如此多元的制作方法和工藝，使人們可以方便地賦予SERS很多功能，因而SERS正逐漸被應用于越來越廣泛的領域。

圖4 (a)BT修飾的Ag-PAO模板的SEM圖，由氧化鋁基質在0.1 M氫氧化鈉溶液中部分分解得到；(b)52°傾角的帶有6納米IPS和150 nm硅納米柱的NOSP二聚體SEM圖；(c)非接觸模式TERS；(d)SHINER：殼分離模式；(e)用納米球印刷術制成的規則SERS基底方法示意圖 Fig.4 (a)SEM image of BT-modified Ag-PAO templates obtained by partial dissolution of the alumina matrix in 0.1 M aqueous NaOH; (b)SEM image at a 52° tilted view of the NOSP dimers with a 6-nm IPS and 150-nm Si pillar height; (c)Tip-enhanced Raman spectroscopy: noncontact mode; (d)SHINERS: shell-isolated mode; (e)schematic diagram of template methods using nanosphere lithography to fabricate ordered nanostructured SERS-active substrates

3 SERS生物傳感

圖5 (a)基于金納米粒子-金納米棒復合體檢測BPA的SERS適體探針示意圖；(b)檢測ATP的SERS比率計硅片適體探針示意圖；(c)銀@介孔硅@銀三層核殼結構納米粒子制備流程示意圖；(d)合成19種SERS編碼納米粒子的編碼、結構及光譜 Fig.5 (a)Scheme of SERS aptasensor for the detection of BPA based on gold nanoparticle-nanorod heteroassembly; (b)Schematic illustration of the ratiometric silicon SERS aptasensor for ATP detection; (c)proposed preparation process of Ag@MSiO2@Ag TCSNPs; (d)codes, structures and measured spectra of the synthesized 19 SERS encoders

在生物檢測應用中，SERS逐漸發展成為一種最常用的多功能方法之一。與其他傳統的生物檢測手段相比，SERS檢測突出的優點包括極窄的峰寬、高靈敏度多元檢測能力和較寬的動態范圍等。構建功能化的SERS探針是SERS生物應用中的一個重要前提。一般而言，在SERS基底上修飾拉曼分子和特定的生物靶向分子就可以獲得面向生物傳感應用的SERS光學探針。圍繞SERS探針進行的生物傳感與檢測成為當今研究的熱點之一[31]。設計該類探針時要考慮到以下幾個方面：SERS活性，靶向效率,納米結構及光學特性的穩定性及多元檢測能力等。為實現特定的生物探測功能，通常會在SERS探針的表面修飾特定的生物靶標分子，如抗體、DNA等。已有報道中，典型的SERS探針結構如圖5所示。Feng Jingjing等人將金納米粒子通過DNA適體連接在金納米棒兩端制成探針[32]，利用在金納米粒子與金納米棒之間非常狹窄的縫隙極強的電磁增強得到顯著的初始SERS信號(圖5(a))。連接二者的適體同時可以作為識別分子與待測物BPA反應而使金納米粒子從納米棒上脫離，導致SERS信號的減弱。故這里的SERS信號強度與待測物的濃度成反比關系。類似的結構還有在金納米星外通過適體DNA連接銀納米粒子而形成衛星型復合結構[33]，其中DNA適體的優點之一是提高了對待測物的靶向性。Shi Huayi等人設計了一種基于適體的探針(圖5(b))，可以特異性的識別待測物ATP并形成環狀的復合物，從而使一開始與其雜交的兩條單鏈DNA分離，最終導致修飾的兩個拉曼分子的SERS信號產生差異而形成SERS比率計型探針[34]。由于靶標分子要識別待測物而使探針整體暴露在環境中，增加了環境中的分子對探針信號影響的風險。Jiang Tao等人在銀納米粒子外包裹一層介孔硅[35]，再在硅殼上吸附一層銀納米粒子形成三層的復合結構，在保證SERS信號強度的前提下提升了探針的穩定性(圖5(c))。

圖6 (a)A：實驗結構示意圖。B：基于SERS的側向流條帶實驗定量檢測HIV-1 DNA的檢測原理。(C為對照組，T為實驗組)；(b)銀納米金字塔由DNA框架自組裝SERS分析生物標志物示意圖。C：通過外泌體、磁球和SERS探針間免疫識別形成的三明治結構；(c)利用BODIPY修飾的納米粒子SERS成像示意圖；(d)SERS探針與基因組DNA的雜交原理示意圖 Fig.6 (a)A:Schematic illustration of the configuration. B:The measurement principle of the SERS-based lateral flow assay for quantification of HIV-1 DNA.(C is the control line and T is the test line); (b)Scheme of Ag pyramids self-assembled by DNA frame for SERS analysis of biomarkers; (c)schematic representation of the targeted SERS imaging using aza-BODIPY attached to NPs; (d)schematic Illustration of the Hybridization between the SERS Nanoprobes and Genome DNA

在合成出功能化的SERS探針之后，即可利用它們進行目標物的檢測。常見的待測物包括DNA、蛋白質、細胞、藥物、離子等。DNA作為一種生物標記物在一些疾病診療上扮演著重要的角色，而Fu Xiuli等人就選取了HIV-1 DNA作為目標物并設計了側向流(LF)條帶實驗來定量檢測分析(圖6(a))[36]。側向流條帶被認為是一種出色的現場護理診斷工具，其與SERS的聯用可以解決低濃度檢測等問題，也證明了SERS可以與很多平臺兼容互補。在腫瘤標志物的檢測中，蛋白質尤其是抗原的檢測占據了很大的比例。Liguang等人利用DNA適體將銀納米粒子組裝成金字塔結構作為SERS探針[37]，可以檢測前列腺抗原(PSA)、凝血酶和粘蛋白三種目標分子(圖6(b))。除了小分子的生物標志物，細胞也是SERS進行生物檢測的目標之一。Nagappanpillai等人將熒光染料BODIPY當作拉曼分子制成SERS探針并用于檢測腫瘤細胞(圖6(c))，這種納米探針的識別效率非常高并且可以進行細胞成像[38]。我們研究組在SERS的生化檢測方面也做了大量的研究工作，例如端粒酶活性檢測[39]、蛋白質免疫檢測[40]、汞離子檢測[41]、農藥檢測[42]等。其中，端粒酶的長度檢測實驗中用著絲粒的SERS強度作為內標排除其他因素對SERS信號的影響，用端粒酶與著絲粒探針強度的比來確定端粒酶長度(圖6(d))。這種SERS原位雜交(in situ hybridization)的靈敏度非常高，可以實現單個端粒酶的檢測。

此外，利用SERS光譜十分窄的特點，人們提出了基于SERS的光譜編碼技術，生成的光譜碼可以用于多元待測物的同時檢測。我們提出了一種波長-光強雙編碼的SERS探針(圖5(d))[43]。利用3種拉曼分子的光譜以及強度兩類不同信息的組合，可得到多達19種不同的SERS光譜。Lai Yuming等人選了5種拉曼分子進行編碼制成SERS探針并用PS微球裝載(圖7(a))，獲得了31種不同光譜編碼的PS球[44]。值得注意的是，將SERS光譜與其他光學手段結合可以顯著提高可編碼容量。例如，我們提出了一種SERS-熒光共編碼的光學編碼新方法(SFJSE)，并利用有機-金屬-量子點復合納米結構構筑了一類SFJSE光學編碼微球作為探針(圖7(b))[45]。這種SFJSE編碼方案借助熒光-SERS聯合光譜拓展了可編碼光譜的有效范圍，與傳統單一熒光信號編碼方法相比，可編碼數量獲得了指數級增長。此外，通過不同種編碼分子錯層分布的策略簡化了編碼微球的設計方案，并大大減輕了信號串擾、制備復雜等問題，對于獲得大編碼容量的微球具有積極意義。

圖7 (a)A：硅殼金納米粒子探針的SERS光譜(左)及拉曼分子的分子結構(右)。B：使用不同拉曼分子的SERS標簽典型的拉曼光譜(左)及相應的編碼(右)。(b) 合成的15種納米粒子的構成、光譜和編碼 Fig.7 (a)A:SERS spectra of AuNPs-Ra@SiO2(left) and molecular structures of Raman reporters employed in this study(right). B:Typical Raman spectra(left) on microbeads with different types of SERS label using different Raman reporter (10000, 01000, 00100,00010, 00001 and 11111) and their corresponding spectral barcodes(right). (b)Composition, measured spectra, and codes of the synthesized 15 nanoparticles

除了高通量檢測本領之外，基底對拉曼散射信號的增強作用使得SERS具有與熒光相當的檢測靈敏度。因此，SERS技術在生物傳感的應用中展現出了優異的檢測性能。另一方面，SERS檢測技術也有局限性。比如，SERS檢測的步驟相對繁瑣以及可重復性相對較低等。因此，開發高效、可重復、自動化的SERS檢測技術成為推廣SERS實際應用時亟待解決的問題之一。近年來迅速發展的微流控芯片技術為人們提供了一種很好的解決方案。

4 微流控SERS檢測芯片及其生物傳感應用

微流控芯片可將樣品預處理、目標物分選以及檢測等多個功能集成到一塊芯片上，以流體和陣列多通道的形式縮短分析時間，為大規模高通量生物分析提供高效的實驗和檢測技術平臺。微流控芯片具有高度的自由定制性及可操作性，若將SERS技術與微流控芯片技術結合，即可獲得自動化的微流控SERS檢測芯片[46]。SERS效應的產生極度依賴于SERS增強基底。因此，微流控SERS檢測芯片的一大關鍵是將SERS基底引入芯片中。根據芯片上SERS基底的類型可以將微流控SERS檢測芯片(SERS-LoC)簡單地分為三種：液態、固態及原位生長基底芯片。

液態基底是最早在微流控SERS檢測芯片中使用的基底。這種基底的操作方法簡單，并且可以直接利用微流中液體流動的特性進行散熱，從而避免大功率激光對待測分子造成的光熱損傷。最簡單的方法是直接將制備好的金屬納米粒子通入微流通道內作為SERS檢測的基底。如圖8(a)，將銀膠通入微流通道內時，銀膠與修飾拉曼分子的DNA連接，形成基底-拉曼分子結構，最終落在SERS檢測區進行檢測[47]。液態的SERS基底最顯著的優點是可以在微流芯片內流動，從而與拉曼分子充分混合。類似的還有圖8(b)中的研究[48]，都是將制備好的金屬納米粒子通入微流通道。在微流控芯片內進行實驗，其反應微環境相對可控，增加了實驗的可靠性并能在一定程度上可以提高檢測的靈敏度。此外，另一種液態基底利用微流控芯片良好的操控性，控制納米粒子流動并讓其聚集在理想的區域或者形成規則密集的聚集體。這些可控的納米粒子聚集體可以提供大量的SERS熱點，因而更有效地增強拉曼信號。目前，這種將流入芯片的納米粒子捕獲在一定區域，并控制納米粒子的形貌、濃度等特征，使其形成納米聚集體成為了液態基底的又一研究方向。如圖8(c)，在PDMS芯片上設置一個氣閥，通過壓力控制擠壓其變形，從而阻止金納米粒子通過而聚集在SERS檢測區形成聚集體。在檢測完畢后釋放壓力使芯片恢復，則金納米粒子可以通過并被清洗掉[49]。然而，這種基于阻塞流通的聚集體形成方法對納米粒子的形貌要求較高，且形成速度較慢。圖8(d)給出了另一種可控納米聚集體的形成方法[50]。Hyundoo等人設計了三層的微流控平臺：透明電極上的光導層、液體空腔及接地電極。當光導層被電磁激發時，電流通過光照區域在空腔內形成一個不均勻的電場，致使金屬納米粒子集中起來形成一個聚集體。并且通過改變光照區域可以在不同位置形成SERS基底。這一巧妙的設計可以很方便的將最簡單的納米粒子聚集在微流芯片上形成需要的聚集體作為基底使SERS信號得到極大增強。

在微流芯片內引入液態基底的方法簡單方便，但液態基底的顯著問題是液體的流動性導致基底形貌不均勻，進而使其產生的熱點分布不均衡。后果是同一批次實驗通道內不同位置的SERS信號強度差異較大，均一性不好。雖然研究者提出了可重復性的基底作為改進，但能更好的解決這一問題的方案就是使用固態的SERS基底。近年來，由于制作工藝發展突飛猛進，許多應用在PDMS上的固態基底研究被報道出來。如圖9(a)，Young等人先用熱蒸發法在PDMS上鍍一層銀，再用氧等離子處理后與玻璃鍵合形成微流通道。同時氧等離子體處理后可以在平展的銀表面生成一些粗糙的微結構以增加熱點而增強SERS信號[51]。在這些精心設計的SERS基底中，一些3D等離子體的結構由于其大面積可吸附分析物的性質吸引了很多研究者的注意。如圖9(b)，在柱形硅陣列上濺射一層薄薄的銀后形成一種被稱為納米柱森林(nanopillar forest)的基底結構被應用在微流芯片內[52]。這一結構最突出的特點是其良好的可重復性，據報道在檢測時相對誤差只有13%。

圖8 (a)集成DNA競爭取代序列檢測的SERRS微流微系統。修飾DNA探針-報告分子對的二氧化硅微球(插圖)充滿一個區塊。當目標序列引入到入口時，拉曼分子的鏈被取代。它們沿著通道流動時與金屬納米聚集體混合并被捕獲在微流芯片中的SERRS檢測區域。(b)A：基于SERS競爭吸附免疫檢測的螺旋線雙通道微流傳感器示意圖。傳感器由兩個平行的通道組成：一個檢測PGA(淺灰)，另一個作對照(深灰)。B：注滿四種不同顏色墨水的芯片圖像。C：磁性免疫檢測的捕獲區域圖。(c)用帶氣閥的通道捕獲與釋放金納米粒子進行SERS檢測的示意圖。(d)光電微流SERS光譜。小量樣品的光電微流設備集成到一個傳統的SERS檢測系統。用一個激光光源可以同時達到使金屬納米粒子聚集和SERS信號的檢測的目的 Fig.8 (a)Microfluidic SERRS microsystem with integrated competitive displacement for DNA sequence detection. Silica microspheres functionalized with DNA probe-reporter pairs(inset) are packed against a frit. When the target sequence is introduced at the inlet, Raman-labeled reporter oligos are displaced. As they flow along the channel, they are mixed with metal nanoclusters and trapped in the microfluidic SERRS detection region. (b)A:Schematic illustration of the solenoid-embedded dual channel microfluidic sensor for SERS-based competitive immunoassay. The sensor is composed of two parallel channels: one for PGA sensing(light gray) and the other for control(dark gray). B:optical images of the solenoid chip filled with four different colors of inks. C:photograph of the capture area for magnetic immunocomplexes. (c)Schematics of trapping and releasing of gold nanoparticles using a modified pneumatic microvalve for SERS detection. (d)Experimental setup for optoelectrofluidic SERS spectroscopy. An optoelectrofluidic device containing a tiny volume of sample droplet is integrated into a conventional SERS detection system. Both concentration of metal nanoparticles for SERS enhancement and detection of SERS signal are simultaneously achieved with a single laser source

圖9 (a)光流控芯片的制做流程；(b)納米柱森林的制造流程及其SEM圖 Fig.9 (a)Device fabrication of the optofluidic SERS chip; (b)Fabrication process for nanopillar forests and SEM images of the obtained nanopillars

圖10 (a)在微流芯片內激光制造SMA的示意圖；(b)A：微流芯片內三個模塊示意圖，分別用紅、綠和藍色方塊表示注射、混合和光學檢測功能區。B：光引導銀納米聚集體的形成過程及原位SERS檢測。注射區的硝酸銀、水、CV和檸檬酸鈉溶液用不同顏色表示。微流通道內的流動用白色箭頭指示 Fig.10 (a)Scheme for laser fabrication of SMAs inside a microfluidic channel; (b)A:schematic of microfluidic chip with three modules functioning as injection, mixing, and optical detection marked by the red, green, and blue squares, respectively. B:the procedure of photoinduced growth of silver nanoaggregates and in situ SERS measurements. The solutions of AgNO3, H2O, CV and sodium citrate in the injection module are represented by different colors. The flow in the microchannel is indicated by the white arrows

此外，還有一類微流控芯片直接在微流芯片內部實現基底的制備并用于檢測，被稱作原位(in situ)生長的SERS基底。如圖10(a)，Xu B B等人用飛秒激光器引導光致還原[53]，在通道內生成銀微花形結構陣列，每一個單體的表面都非常粗糙，以此為基底可以產生很強的SERS增強效果。類似的，Yan W等人在微流內利用光化學還原銀納米聚集體[54]，并發現在第一次光照還原生成納米粒子后將其洗去接著第二次在相同的激光下再次生成大量細小的銀納米粒子，這一關鍵的步驟直接導致在通道內產生了大量的熱點，而使得在檢測SERS信號時可以增強一個數量級(圖10(b))。

隨著微流芯片內SERS基底制備技術的不斷改進與優化，SERS信號的靈敏度、特異性和可重復性得到了進一步的改善。微流控芯片與SERS技術二者的協同作用使得SERS-微流芯片(SERS-LoC)的應用越來越廣泛[55]。

4.1 生物檢測

SERS的特異性與無損特性使其非常適合生物醫學方面的研究。再加上微流芯片的穩定性、靈活性與微量樣品檢測的特性，目前，SERS-LoC的生物檢測應用取得了不少突出的進展[56-67]。

圖11 (a)在硅片上修飾銀納米粒子作為基底集成在微流芯片上，A：一步法，B：兩步法檢測miRNA；(b)基于SERS的液滴微流傳感器免清洗的磁性免疫檢測示意圖。這種傳感器由5個部分組成，功能如下：i液滴生成及試劑混合；ii形成磁性免疫復合物；iii磁鐵分離免疫復合物；iv含有上清的更大的液滴生成來進行SERS檢測；v含有磁性免疫復合物的更小的液滴生成；(c)微流芯片構成及概念示意圖。細胞預先標記腫瘤特異性與對照探針(后者兩種細胞都有修飾)，再注入芯片中，流向中心匯集后通過拉曼激光照射；(d)微流芯片示意圖：A：頂視圖 B：側視圖。這一設備有兩層：液體流動層(黑線)和調節流動層連接的控制層(粉色和藍色圖案)。在側視圖中芯片由3個功能區域組成。區域I：細胞培養池(癌細胞)；區域II：抗體條碼(不同通道內基底與抗體相匹配)；區域III：細胞培養池(免疫細胞被基底上的抗體捕獲) Fig.11 (a)Microfluidic chip integrating pSi membranes decorated by Ag NPs and detection schemes of miRNA by A:one-step hybridization assay, B:two-step hybridization assay; (b)schematic illustration of the SERS-based microdroplet sensor for wash-free magnetic immunoassay. The sensor is composed of five compartments with the following functions: (i)droplet generation and reagent mixing, (ii)formation of magnetic immunocomplexes, (iii)magnetic bar-mediated isolation of immunocomplexes, (iv)generation of larger droplets containing the supernatant for SERS detection and (v)generation of smaller droplets containing magnetic immunocomplexes; (c)schematic of setup and concept. Cells, prelabeled with a cocktail of cancer-specific(NRP) and control(UC) SBTs (the latter binding both cell types), are injected into the device, where they are flow-focused before passing through the Raman laser; (d)schematic illustration of a microfluidic chip: A: top view and B: side view. The device contains two layers: a flow layer (black line) for transport of fluids and a control layer(pink and blue pattern) to regulate the connections in the flow layer. In the side view, the chip is composed of three functional sections. Section I the cell culture chamber (cancer cells); section II:antibody barcode(the substrate is patterned with various antibodies in different channels); section III:the cell culture chamber(immune cells are captured by the antibody on the substrate)

與在溶液中類似的檢測原理，在微流控芯片中也可以利用SERS光譜來進行生物標志物的檢測。miRNA是一種控制基因表達的非編碼RNA，參與了生物體的很多過程。Novara C等人在微流芯片上制作了兩種SERS基底(圖11(a))，分別檢測帶拉曼標記的miRNA和無標記的miRNA[58]。抗原作為最重要的腫瘤標志物之一也被引入到SERS微流芯片中。Gao R等人制作了液滴的微流系統(圖11(b))，將磁球作為捕獲基底，同時加入待測物PSA和SERS探針后在微流內充分混合[59]。最后用磁鐵將反應生成的磁球-PSA-探針免疫復合物分離，通過檢測通道內剩余探針的SERS信號來反映待測物的濃度。微流控芯片的一大優勢是可以模擬體液流動環境，這給識別并收集體內的循環腫瘤細胞(CTC)提供了研究平臺。Pallaoro Alessia等人在微流通道內注入腫瘤細胞與正常細胞的混合液并使其排成一列流動(圖11(c))，通過激光照射區域得到SERS信號并利用兩種分析方法即主成分分析(PCA)和最小二乘法進行分析[60]。除了直接對細胞進行識別和分析，檢測細胞分泌物作為研究細胞間通信的基礎也是生物檢測分析的一大課題。我們也提出了一種SERS微流芯片內用于實時監測細胞間通信的方法(圖11(d))[61-62]。該芯片結合了SERS光譜編碼技術與蛋白質陣列的空間編碼技術，將大量待測樣品中蛋白質的種類和含量信息加載到基于SERS的三維碼中，只需通過三維碼的解碼即可獲取所有樣品中各種蛋白質的含量信息，該檢測平臺具有信息量大、檢測靈敏度高(～10 fg/mL)、響應速度快(30 min)、操作簡便等優點。

4.2 離子檢測

小分子或離子的檢測要求檢測方法具有優異的可靠性與靈敏度。SERS-LoC的一系列優秀的特性使其成為檢測小分子或離子的非常有力的工具[63]。

硫氰酸離子作為評價人體健康的重要標記分子廣泛存在于體液中，檢測體內硫氰酸離子的濃度對臨床診斷與疾病預防很有意義。砷作為一種環境中普遍存在的污染物影響著人們的健康，圖12(a)中展示了一種間接檢測砷離子的策略[64]。Nan等人將銀納米粒子修飾谷胱甘肽(GSH)和拉曼分子作為探針，在之字形微流通道內使砷離子與探針充分混合，其中砷離子與谷胱甘肽結合可以導致銀粒子的聚集從而增強SERS信號。這種方法可以檢測低至6.7×10-10g/mL的砷離子。我們設計了一種液滴SERS微流控系統[65]，將樣品與銀殼金納米棒混合形成液滴在通道內流動并進行快速的SERS檢測(圖12(b))。這種方法在人血清中檢測動態范圍達到4到256 μM并可以實現真實唾液樣本的檢測。

圖12 (a)A：用來檢測砷離子的微流芯片示意圖。砷離子與GSH/4-MPY修飾的納米粒子在之字形微流通道內快速、充分混合(插圖)。B：砷離子的分析原理。當砷離子與GSH/4-MPY修飾的納米粒子耦合時發生聚集，銀納米粒子上的4-MPY的拉曼信號被增強；(b)A：液滴微流設備的示意圖。B：銀殼金納米棒的SERS光譜(紅色)及加入硫氰酸離子后的SERS光譜(藍色) Fig.12 (a)A:schematic diagram of the microfluidic chip used for analyzing the As(III) ions. The rapid, full mixing of the As(III) ions and GSH/4-MPY functionalized AgNPs achieved in a zigzag(75 angles) microfluidic channel(inset). B:the analytical principle for As(III) ions. When As(III) ions couple with GSH/4-MPY functionalized AgNPs, aggregation occurs and the Raman signals are improved when 4-MPY is adsorbed on the surface of the AgNPs; (b)A:schematic illustration of the droplet microfluidic device. B:SERS spectra of CTAB-stabilized Au@Ag NRs(red curve) and Au@Ag NRs with the addition of SCN-(blue curve)

4.3 便攜的SERS-LoC

利用高集成度的芯片可以在一塊芯片上完成整個復雜的實驗，使得微流芯片直接代替了實驗室的環境，微小的尺寸使其有很好的便攜性，可在任意地方進行實驗。然而對于SERS而言，由于檢測時需要光學校準和對焦等復雜過程，將SERS-LoC做成便攜的設備成為不小的挑戰。近來，光流控(optofluidic)的發展解決了這一困難[66]。如圖13(a)，Soroush等人將光纖元件集成到微流芯片上消除了SERS檢測時光學對焦等負擔[67]，使現場(on-site)SERS檢測成為可能。除此之外，手持的拉曼光譜儀也可以用來實現SERS的現場分析[68]。圖13(b)顯示了Kim等人提出的將芯片內的納米柱陣列作為SERS基底，運用手掌大小的便攜拉曼光譜儀進行在現場的SERS檢測牛奶中的三聚氰胺[69]。這種簡便的拉曼光譜儀并沒有降低檢測靈敏度，實驗在水溶液中檢測限達到1.2×10-10g/mL，而在奶粉提取物中檢測限為1.0×10-10g/mL，均達到了FDA要求的標準。隨著更多簡易方便的平臺被研究出來[70]，為現場SERS檢測而準備的便攜設備越來越成熟。

圖13 (a)A：光流控SERS微系統示意圖。B：光流控SERS系統。C：充滿的微球和集成的光纖；(b)牛奶中三聚氰胺檢測的比較使用A：標準的FDA過程和B：我們的納米柱檢測方案。在顯示金納米柱芯片用于分子檢測同時展示的具有代表性的SEM圖為打開(左)和關閉(右)的金納米柱五聚物分別對應處理過濾的牛奶前后 Fig.13 (a)A:schematic of optofluidic SERS microsystem. B:photo of optofluidic SERS microsystem. C:micrograph of packed microspheres and integrated fiber optic cables; (b)Comparison of melamine sensing in milk using A:a standard FDA procedure versus B: our nanofinger-based sensing solution. The representative SEM images of open(left) and closed(right) pentamer gold nanofingers before and after treatment with the filtered milk, respectively, are shown along with the illustration of how the gold nanofinger chips were used for molecular sensing

5 結束語

綜上所述，本文簡單介紹了SERS的原理，著重從基底的設計上敘述了SERS的發展。接下來總結了幾種SERS在生物傳感中的應用，主要從SERS探針的制備和不同待測物的檢測兩方面進行概述。通過將SERS基底引入到微流芯片內形成微流控SERS檢測芯片(SERS-LoC)。在微流控SERS檢測芯片中，無論是液態、固態還是原位生長的SERS基底都有其特點及應用背景。最后，我們討論了目前微流控SERS檢測芯片的幾種應用。檢測的分析物有DNA、抗原、生物標志物、細胞、汞離子、砷離子等。隨著科學技術的發展SERS-LoC系統也逐漸趨于便攜性，出現了手持的設備，為真正的on-site現場檢測提供了有力幫助。

盡管微流控SERS檢測芯片已經取得了引人注目的研究進展，然而檢測特異性與可重復性、芯片的多功能化與集成度的提高等依舊是微流控SERS檢測芯片今后的研究目標。尤其是如何直接使用實際臨床生物樣本進行目標物的檢測。實際臨床樣品(如病人的血液)很復雜，它們往往含有豐富的蛋白質、DNA等。這些生物大分子在SERS檢測的過程中都有可能提供非特異性的噪聲信號，從而造成假陽性或假陰性的檢測結果，嚴重影響檢測結果的可靠性。因此，對于實際樣品來說，微流控SERS檢測芯片的特異性問題尤為重要。通常，解決微流控SERS檢測芯片的特異性問題可從兩點出發。首先，優化SERS基底或探針的生物功能化修飾，提高基底或探針識別待測物的選擇性和準確性；其次，在微流芯片內增加可對待測物進行篩選的功能單元，例如物理尺寸篩選或化學配體識別篩選，盡可能地排除其他物質的非特異性干擾。若微流控SERS檢測芯片能夠對實際的復雜生物樣品進行高準確性地測試，則必將極大地推進微流控SERS檢測芯片在臨床診斷與治療中的應用。此外，低成本的自動化微流控SERS檢測芯片也是今后人們研究的重點目標之一。其關鍵是如何在保證完善的傳感與分析功能的前提下，盡可能降低芯片的制作成本。低成本的微流控SERS芯片對于欠發達地區的生化檢測(如疾病普查、環境監測等)具有非常重要的社會價值與現實意義。在將來，SERS與微流控芯片技術進一步發展，如將激光、光譜儀等設備集成到芯片上后會更大程度上發揮SERS-LoC的作用，為現場實時檢測技術的完善作出巨大貢獻，屆時生命健康科學、生物醫學等方面會極大受益。可以預見的是，隨著功能的不斷完善和性能的不斷提高，集成的、自動化的SERS-LoC芯片必然會成為生物傳感檢測領域中一項非常重要的技術。

參考文獻：

[1] VAN DEN BERG A,BERGVELD P. Labs-on-a-chip:origin, highlights and future perspectives. On the occasion of the 10th microtas conference[J].Lab.Chip,2006,6(10):1266-1273.

[2] HUANG J A,ZHANG Y L,DING H,etal.. SERS-enabled lab-on-a-chip systems[J].AdvancedOpticalMaterials,2015,3(5):618-633.

[3] CARRASCOSA L G,HUERTAS C S,LECHUGA L M. Prospects of optical biosensors for emerging label-free RNA analysis[J].Trac-TrendsinAnalyticalChemistry,2016,80:177-189.

[4] AVELLA-OLIVER M,PUCHADES R,WACHSMANN-HOGIU S,etal.. Label-free SERS analysis of proteins and exosomes with large-scale substrates from recordable compact disks[J].SensorsandActuatorsB-Chemical,2017,252:657-662.

[5] ZRIMSEK A B,CHIANG N H,MATTEI M,etal.. Single-molecule chemistry with surface- and tip-enhanced Raman spectroscopy[J].ChemicalReviews,2017,117(11):7583-7613.

[6] WU L,WANG Z,ZONG S,etal.. Simultaneous evaluation of p53 and p21 expression level for early cancer diagnosis using SERS technique[J].Analyst,2013,138(12):3450-3456.

[7] NGUYEN A H,LEE J,CHOI H I,etal.. Fabrication of plasmon length-based surface enhanced Raman scattering for multiplex detection on microfluidic device[J].Biosensors&Bioelectronics,2015,70:358-365.

[8] JAHN I J,ZUKOVSKAJA O,ZHENG X S,etal.. Surface-enhanced Raman spectroscopy and microfluidic platforms:challenges, solutions and potential applications[J].Analyst,2017,142(7):1022-1047.

[9] ZHOU Q,KIM T. Review of microfluidic approaches for surface-enhanced Raman scattering[J].SensorsandActuatorsB-Chemical,2016,227:504-514.

[10] RAMAN C V,KRISHNAN K S. A new type of secondary radiation(reprinted from nature,vol 121,pp 501-502,1928)[J].CurrentScience,1998,74(4):381-381.

[11] FLEISCHMANN M,HENDRA P J,MCQUILLAN A J. Raman-spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode[J].ChemicalPhysicsLetters,1974,26(2):163-166.

[12] SCHLUCKER S. Surface-enhanced Raman spectroscopy:concepts and chemical applications[J].AngewandteChemieInternationalEdition,2014,53(19):4756-4795.

[13] LE RU E C,MEYER S A,ARTUR C,etal.. Experimental demonstration of surface selection rules for SERS on flat metallic surfaces[J].ChemicalCommunications(Camb),2011,47(13):3903-3905.

[14] HARMSEN S,HUANG R M,WALL M A,etal.. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging[J].ScienceTranslationalMedicine,2015,7(271):11.

[15] ZHOU J J,XIONG Q R,MA J L,etal.. Polydopamine-enabled approach toward tailored plasmonic nanogapped nanoparticles:from nanogap engineering to multifunctionality[J].ACSNano,2016,10(12):11066-11075.

[16] DING S Y,YI J,LI J F,etal.. Nanostructure-based plasmon-enhanced Raman spectroscopy for surface analysis of materials[J].NatureReviewsMaterials,2016,1(6):16021.

[17] ZONG S,WANG Z,CHEN H,etal.. Ultrasensitive telomerase activity detection by telomeric elongation controlled surface enhanced Raman scattering[J].Small,2013,9(24):4215-4220.

[18] ZONG S,WANG Z,CHEN H,etal. Assessing telomere length using surface enhanced Raman scattering[J].ScientificReports,2014,4:6977.

[19] WANG Z,ZONG S,YANG J,etal. One-step functionalized gold nanorods as intracellular probe with improved SERS performance and reduced cytotoxicity[J].BiosensorsandBioelectronics,2010,26(1):241-247.

[20] SENAPATI D,SINGH A K,RAY P C. Real time monitoring of the shape evolution of branched gold nanostructure[J].ChemicalPhysicsLetters,2010,487(1):88-91.

[21] REGUERA J,LANGER J,DE ABERASTURI D J,etal.. Anisotropic metal nanoparticles for surface enhanced Raman scattering[J].ChemicalSocietyReviews,2017,46(13):3866-3885.

[22] PEI Y,WANG Z,ZONG S,etal.. Highly sensitive SERS-based immunoassay with simultaneous utilization of self-assembled substrates of gold nanostars and aggregates of gold nanostars[J].JournalofMaterialsChemistryB,2013,1(32):3992.

[23] SONG C,WANG Z,ZHANG R,etal.. Highly sensitive immunoassay based on Raman reporter-labeled immuno-Au aggregates and SERS-active immune substrate[J].BiosensorsandBioelectronics,2009,25(4):826-831.

[24] LIU M,WANG Z,ZONG S,etal.. SERS-based DNA detection in aqueous solutions using oligonucleotide-modified Ag nanoprisms and gold nanoparticles[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2013,405(18):6131-6136.

[25] WUSTHOLZ K L,HENRY A-I,MCMAHON J M,etal.. Structure-activity relationships in gold nanoparticle dimers and trimers for surface-enhanced Raman spectroscopy[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2010,132(31):10903-10910.

[26] GELLNER M,STEINIGEWEG D,ICHILMANN S,etal.. 3d self-assembled plasmonic superstructures of gold nanospheres:synthesis and characterization at the single-particle level[J].Small,2011,7(24):3445-3451.

[27] LEE S J,MORRILL A R,MOSKOVITS M. Hot spots in silver nanowire bundles for surface-enhanced Raman spectroscopy[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2006,128(7):2200-2201.

[28] CHIRUMAMILLA M,TOMA A,GOPALAKRISHNAN A,etal.. 3d nanostar dimers with a sub-10-nm gap for single-/few-molecule surface-enhanced Raman scattering[J].AdvancedMaterials,2014,26(15):2353-2358.

[29] LI J F,HUANG Y F,DING Y,etal.. Shell-isolated nanoparticle-enhanced Raman spectroscopy[J].Nature,2010,464(7287):392-395.

[30] WU D Y,LI J F,REN B,etal.. Electrochemical surface-enhanced Raman spectroscopy of nanostructures[J].ChemicalSocietyReviews,2008,37(5):1025-1041.

[31] WANG Z,ZONG S,WU L,etal.. SERS-activated platforms for immunoassay:probes, encoding methods, and applications[J].ChemicalReviews,2017,117(12):7910-7963.

[32] FENG J,XU L,CUI G,etal.. Building SERS-active heteroassemblies for ultrasensitive bisphenol a detection[J].BiosensorsandBioelectronics,2016,81:138-142.

[33] LI A,TANG L,SONG D,etal.. A SERS-active sensor based on heterogeneous gold nanostar core-silver nanoparticle satellite assemblies for ultrasensitive detection of aflatoxinb1[J].Nanoscale,2016,8(4):1873-1878.

[34] SHI H,CHEN N,SU Y,etal.. Reusable silicon-based surface-enhanced Raman scattering ratiometric aptasensor with high sensitivity, specificity, and reproducibility[J].AnalyticalChemistry,2017,89(19):10279-10285.

[35] JIANG T,WANG X,ZHOU J,etal. Hydrothermal synthesis of Ag@mSiO2@Ag three core-shell nanoparticles and their sensitive and stable SERS properties[J].Nanoscale,2016,8(9):4908-4914.

[36] FU X,CHENG Z,YU J,etal.. A SERS-based lateral flow assay biosensor for highly sensitive detection of HIV-1 DNA[J].BiosensorsandBioelectronics,2016,78:530-537.

[37] XU L,YAN W,MA W,etal.. SERS encoded silver pyramids for attomolar detection of multiplexed disease biomarkers[J].AdvancedMaterials,2015,27(10):1706-1711.

[38] ADARSH N,RAMYA A N,MAITI K K,etal.. Unveiling nir Aza-boron-dipyrromethene(bodipy) dyes as raman probes: Surface-enhanced Raman scattering(SERS)-guided selective detection and imaging of human cancer cells[J].Chemistry,2017,23(57):14286-14291.

[39] ZONG S,CHEN C,WANG Z,etal. Surface enhanced Raman scattering based in situ hybridization strategy for telomere length assessment[J].ACSNano,2016,10(2):2950-2959.

[40] ZONG S,WANG Z,ZHANG R,etal. A multiplex and straightforward aqueous phase immunoassay protocol through the combination of SERS-fluorescence dual mode nanoprobes and magnetic nanobeads[J].BiosensorsandBioelectronics,2013,41:745-751.

[41] LIU M,WANG Z,PAN L,etal.. A SERS/fluorescence dual-mode nanosensor based on the human telomeric g-quadruplex DNA:application to mercury(ii) detection[J].BiosensorsandBioelectronics,2015,69:142-147.

[42] ZHANG Y,WANG Z,WU L,etal.. Rapid simultaneous detection of multi-pesticide residues on apple using sers technique[J].Analyst,2014,139(20):5148-5154.

[43] ZHU D,WANG Z,ZONG S,etal.. Wavenumber-intensity joint SERS encoding using silver nanoparticles for tumor cell targeting[J].RSCAdvances,2014,4(105):60936-60942.

[44] LAI Y,SUN S,HE T,etal. Raman-encoded microbeads for spectral multiplexing with SERS detection[J].RCSAdvances,2015,5(18):13762-13767.

[45] WANG Z,ZONG S,LI W,etal.. SERS-fluorescence joint spectral encoding using organic-metal-qd hybrid nanoparticles with a huge encoding capacity for high-throughput biodetection:putting theory into practice[J].JournaloftheAmericanChemicalSociety,2012,134(6):2993-3000.

[46] HIDI I J,JAHN M,WEBER K,etal.. Lab-on-a-chip-surface enhanced Raman scattering combined with the standard addition method:toward the quantification of nitroxoline in spiked human urine samples[J].AnalyticalChemistry,2016,88(18):9173-9180.

[47] YAZDI S H,GILES K L,WHITE I M. Multiplexed detection of DNA sequences using a competitive displacement assay in a microfluidic SERRS-based device[J].AnalyticalChemistry,2013,85(21):10605-10611.

[48] GAO R,KO J,CHA K,etal.. Fast and sensitive detection of an anthrax biomarker using SERS-based solenoid microfluidic sensor[J].BiosensorsandBioelectronics,2015,72:230-236.

[49] ZHOU J,REN K,ZHAO Y,etal.. Convenient formation of nanoparticle aggregates on microfluidic chips for highly sensitive SERS detection of biomolecules[J].AnalyticalandBioanalyticalChemistry,2012,402(4):1601-1609.

[50] HWANG H,HAN D,OH Y J,etal.. In situ dynamic measurements of the enhanced SERS signal using an optoelectrofluidic sers platform[J].Lab.Chip,2011,11(15):2518-2525.

[51] OH Y J,JEONG K H. Optofluidic SERS chip with plasmonic nanoprobes self-aligned along microfluidic channels[J].Lab.Chip,2014,14(5):865-868.

[52] MAO H,WU W,SHE D,etal.. Microfluidic surface-enhanced Raman scattering sensors based on nanopillar forests realized by an oxygen-plasma-stripping-of-photoresist technique[J].Small,2014,10(1):127-134.

[53] XU B B,ZHANG R,LIU X Q,etal.. On-chip fabrication of silver microflower arrays as a catalytic microreactor for allowing in situ SERS monitoring[J].ChemicalCommunications(Camb),2012,48(11):1680-1682.

[54] YAN W,YANG L,CHEN J,etal. In situ two-step photoreduced SERS materials for on-chip single-molecule spectroscopy with high reproducibility[J].AdvancedMaterials,2017,29(36)

[55] MUEHLIG A,BOCKLITZ T,LABUGGER I,etal.. Loc-sers: A promising closed system for the identification of mycobacteria[J].AnalyticalChemistry,2016,88(16):7998-8004.

[56] HIDI I J,JAHN M,PLETZ M W,etal.. Toward levofloxacin monitoring in human urine samples by employing the LoC-SERS technique[J].JournalofPhysicalChemistryC,2016,120(37):20613-20623.

[57] ZOU K,GAO Z,DENG Q,etal.. Picomolar detection of carcinoembryonic antigen in whole blood using microfluidics and surface-enhanced Raman spectroscopy[J].Electrophoresis,2016,37(5-6):786-789.

[58] NOVARA C,CHIADO A,PACCOTTI N,etal.. SERS-active metal-dielectric nanostructures integrated in microfluidic devices for label-free quantitative detection of miRNA[J].FaradayDiscuss,2017,

[59] GAO R,CHENG Z,DEMELLO A J,etal.. Wash-free magnetic immunoassay of the psa cancer marker using SERS and droplet microfluidics[J].Lab.Chip,2016,16(6):1022-1029.

[60] PALLAORO A,HOONEJANI M R,BRAUN G B,etal.. Rapid identification by surface-enhanced Raman spectroscopy of cancer cells at low concentrations flowing in a microfluidic channel[J].ACSNano,2015,9(4):4328-4336.

[61] WU L,WANG Z,ZHANG Y,etal.. In situ probing of cell-cell communications with surface-enhanced Raman scattering(SERS) nanoprobes and microfluidic networks for screening of immunotherapeutic drugs[J].NanoResearch,2016,10(2):584-594.

[62] WU L,WANG Z,FAN K,etal.. A SERS-assisted 3d barcode chip for high-throughput biosensing[J].Small,2015,11(23):2798-2806.

[63] PATZE S,HUEBNER U,LIEBOLD F,etal.. SERS as an analytical tool in environmental science:the detection of sulfamethoxazole in the nanomolar range by applying a microfluidic cartridge setup[J].AnalyticaChimicaActa,2017,949:1-7.

[64] QI N,LI B,YOU H,etal.. Surface-enhanced Raman scattering on a zigzag microfluidic chip:towards high-sensitivity detection of As(Ⅲ) ions[J].AnalyticalMethods,2014,6(12):4077-4082.

[65] WU L,WANG Z,ZONG S,etal.. Rapid and reproducible analysis of thiocyanate in real human serum and saliva using a droplet SERS-microfluidic chip[J].BiosensorsandBioelectronics,2014,62:13-18.

[66] CHOI J,LEE K S,JUNG J H,etal.. Integrated real-time optofluidic SERS via a liquid-core/liquid-cladding waveguide[J].RSCAdvances,2015,5(2):922-927.

[67] YAZDI S H,WHITE I M. Optofluidic surface enhanced Raman spectroscopy microsystem forsensitive and repeatable on-site detection of chemical contaminants[J].AnalyticalChemistry,2012,84(18):7992-7998.

[68] HAN Z,LIU H,MENG J,etal.. Portable kit for identification and detection of drugs in human urine using surface-enhanced Raman spectroscopy[J].AnalyticalChemistry,2015,87(18):9500-9506.

[69] KIM A,BARCELO S J,WILLIAMS R S,etal.. Melamine sensing in milk products by using surface enhanced Raman scattering[J].AnalyticalChemistry,2012,84(21):9303-9309.

[70] VILLA J E L,POPPI R J. Aportable SERS method for the determination of uric acid using a paper-based substrate and multivariate curve resolution[J].Analyst,2016,141(6):1966-1972.