光纖生物傳感器在HER3抗體藥物定量檢測中的應用

史健松，于源華，王美嬌，吳再輝，石 鑫，張 昊，宮 平，嵇曉強*

(1.長春理工大學 生命科學技術學院，吉林 長春 130022；2.長春理工大學 光電信息學院，吉林 長春 130114)

1 引 言

生物分子相互作用研究是現代生命科學研究的重大問題之一[1]。生物分子的親和性檢測是指通過實時監測其相互作用過程，獲得分子間是否發生作用，作用強度等信息，得到分子間相互作用的動力學參數，并進行定性及定量的分析，是一種在分子水平闡明生物分子之間或分子與其他物質間相互作用本質，揭示微觀生命活動規律的重要方法。該方法具有檢測時間短，測量準確、精度高、成本低廉等特點，對生物醫學標記物、核酸、蛋白質、病毒、細菌及毒素的檢測、藥物作用機理的研究、臨床用藥篩選等方面有著廣泛的應用[2-4]，是目前檢測領域研究熱點。

目前，生物分子親和性動態檢測技術主要有表面等離子體共振技術(SPR)、熒光共振能量轉移技術(FRET)和光干涉生物傳感檢測技術(RIfS)等新型檢測方法[5]。其中表面等離子體共振技術(SPR)是一種光學物理現象。當一束偏振光在一定的角度范圍內入射到棱鏡端面，在棱鏡與金屬薄膜(Au或Ag)的界面將產生表面等離子波。當入射光波的傳播常數與表面等離子波的傳播常數相匹配時，引起金屬膜內自由電子產生共振，即表面等離子共振。分析時，先在傳感芯片表面固定一層生物分子識別膜，然后將待測樣品流過芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識別膜相互作用的分子，會引起金膜表面折射率變化，最終導致SPR角度變化，通過檢測SPR角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動力學常數和特異性等信息；FRET是一種高效的光學“分子尺”，是指能量從一種受激發的熒光基團以非輻射的方式轉移到另一種熒光基團的物理現象。在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸檢測等方面有廣泛的應用，為在活細胞生理條件下對蛋白質-蛋白質間相互作用進行實時的動態研究提供了便利[6]；但上述兩種技術對溫度、樣品組成等干擾因素非常敏感，同時設備包括很多光學和機械部分以及液路系統，導致體積大、結構復雜，使得系統優化和商業化很難實現。

目前，國內基于光纖傳感器的生物親和性檢測設備研究屬于空白，相關產品未見報導，且國外設備一般設備昂貴。本文根據反射膜厚度的改變對干涉光強度的影響，設計了自聚焦透鏡與光纖探針耦合的光學傳輸系統，搭建了光干涉生物親和性傳感檢測系統，自主研發了可實現生物分子間親和性檢測的新型裝置。

2 光干涉生物親和性檢測原理

本文所述基于光干涉原理的RIfS技術，基于生物薄膜干涉技術，在光纖制成的生物傳感器底端覆蓋生物分子相容層，形成生物膜層。當分析物結合傳感器底端偶聯的配體時，生物膜層厚度增加，反射光干涉光譜曲線產生可測量的漂移，從而實時監測光纖探針表面由生物分子間相互作用引起的生物分子膜厚度的改變。采用微型光纖光譜儀捕獲可見光范圍內的干涉光譜曲線，通過建立干涉光譜偏移量與生物分子膜厚度變化量間的量化關系，實現生物分子間相互作用過程的靈敏、快速、高通量實時監測，獲得生物分子的有無、濃度及動力學參數等生物學信息。與其它熒光標記或非標記生物分子親和性檢測技術相比較，避免了熒光基團標記容易導致生物分子活性下降，倏逝場技術的熱穩定性差，微流控系統管路容易堵塞及通量低等缺點[7-8]。

該系統由光學系統、電控系統、信號處理系統組成，其中光學系統中光纖探針后端與“Y”型光纖連接，“Y”型光纖一端接可見光光源，一端接光電倍增管；將光纖探針侵入到待檢測樣本中，當固定在探針端面的生物膜層特異性分子與被檢測分子發生相互作用時，能夠引起端面生物膜層厚度的改變，當具有一定帶寬的可見光入射到光纖探針端面時，根據薄膜干涉的簡化模型和光線反射折射特性，圖1給出了光干涉生物親和性傳感檢測原理圖中，入射光線I在光纖探針端面分成兩個部分，一部分入射光在界面n0上反射，另一部分透過界面n0，在界面n1反射，然后在投射面n0射出。

圖1 光干涉生物親和性傳感檢測原理 Fig.1 Bioaffinity sensing detection principle based on the light interference

當光纖探針端面發生生物分子結合反應時，由于生物分子折射率與干涉層折射率相近，相當于干涉層厚度增加，入射光在光纖探針端面分別產生兩束反射光Ⅰ和Ⅲ，由此產生的干涉光譜曲線較生物分子反應前向波長增加方向偏移；同理，當生物分子發生解離反應時，干涉光譜曲線向波長減小方向偏移。通過實時監測生物分子間相互作用的干涉光譜曲線，獲得曲線的實時偏移量，從而能夠計算光纖探針端面生物分子膜層厚度相對變化量，并實現生物分子的有無、濃度及相互作用動力學參數的測定[9-10]。

由上述光干涉生物親和性檢測原理可知，干涉光譜曲線極值點越尖銳，光譜儀捕獲生物分子反應前、后干涉光譜極值點處的波長值越精確，計算獲得的生物分子膜層相對厚度越精確。

本文基于光干涉生物親和性檢測原理，采用光纖生物傳感器實現分子互作檢測。該方法首先由光學傳輸單元、光纖探針、微型光纖光譜儀實時監測生物分子相互作用干涉光譜，然后對干涉光譜噪聲信號進行處理，接下來對光纖探針端面的生物分子膜層厚度進行計算，最終實現生物分子間是否發生相互作用、相互作用特異性與親和性、生物分子的定性與定量等信息的快速測定。

3 光學系統設計

基于光纖生物傳感器的光干涉生物親和性檢測系統的光學部分主要由微型光纖光譜儀、光源、“Y”型分叉光纖、光纖探針等組成。全波段鹵鎢燈作為光源；用“Y”型分叉光纖將光源、光纖探針與微型光纖光譜儀連接起來，組成光學傳輸單元；光纖探針表面由TiO2+SiO2+生物分子層3部分構成，是實現生物分子間相互作用并產生光干涉現象的重要單元，如圖2所示。

圖2 光學系統及光纖探針示意圖 Fig.2 Schematic diagram of optical system and optical fiber probe

其中，“Y”型分叉光纖與光纖探針連接(圖3所示)，實現光源與干涉光的光學傳輸，其光耦合效率直接決定了系統的測試性能。“Y”型分叉光纖與光源及微型光纖光譜儀間的連接部分為不銹鋼標準螺紋接口，匹配良好。但與光纖探針連接時，由于光纖探針接口采用注塑工藝加工，光纖探針為一次性使用，因此入射光在與光纖探針連接端面容易發生反射和散射等雜散光干擾，不同光纖探針與Y型傳輸光纖連接時，人為裝調會產生偏心和傾斜等問題，從而降低光學傳輸系統的光耦合效率，降低檢測系統穩定性。

圖3 “Y”型光纖和光纖探針連接示意圖 Fig.3 Connection schematic diagram of “Y” type optical fiber and optical fiber probe

為了減小雜散光干擾，提高光耦合效率，提高檢測系統性能，本文提出了自聚焦透鏡與石英光纖探針耦合的光學傳輸系統。

自聚焦透鏡又稱為梯度變折射率透鏡，是指其折射率分布是沿徑向漸變的柱狀光學透鏡，具有數值孔徑大、直徑小、焦距短、平端面、聚焦好的特點，與普通透鏡的區別在于，能夠使沿軸向傳輸的光產生折射，并使折射率的分布沿徑向逐漸減小，實現出射光線被平滑且連續的匯聚到一點[11]。圖4是普通透鏡和自聚焦透鏡的光軌跡示意圖。

圖4 普通透鏡和自聚焦透鏡光路 Fig.4 Optical paths of ordinary lens and self-focusing lens

石英光纖探針為全反射光傳輸方式，光傳輸效率高。采用ZEMAX光學設計軟件對自聚焦透鏡與石英光纖探針耦合結構進行設計與光耦合效率模擬，結果如圖5所示，半徑為10 mm正光焦度、厚度為1 mm的K9自聚焦透鏡與直徑為21 mm的石英光纖耦合結構，可大大提高光耦合效率，相對照度能夠達到1.0，實現了對光源的充分利用。

圖5 自聚焦透鏡與石英光纖耦合結構光路效率仿真圖 Fig.5 Simulation block diagram of optical path efficiency of the self-focusing lens and quartz optical fiber probe coupling structure

圖6 自聚焦透鏡與石英光纖探針耦合結構給定偏心0.02 mm公差后的光斑足跡圖 Fig.6 Spot footprint of the self-focusing lens and quartz optical fiber probe coupling structure given eccentricity 0.02 mm

圖7 自聚焦透鏡與石英光纖探針耦合結構給定傾斜0.1°公差后的光斑足跡圖 Fig.7 Spot footprint of the self-focusing lens and quartz optical fiber probe coupling structure given tilt 0.1 degrees of tolerance

設計過程中在“Y”型分叉光纖與光纖探針間加工一個斷面，加入自聚焦透鏡，研究耦合的偏心與傾斜對系統光傳輸性能的影響。仿真結果如圖5所示，“Y”型分叉光纖與一次性石英光纖探針連接時，中間耦合自聚焦透鏡，能夠最大限度放寬石英光纖與Y型分叉光纖連接的偏心與傾斜公差，偏心公差應小于0.02 mm，傾斜公差可小于0.1°，兩種情況下的光斑足跡圖如圖6、7所示。出射光的光斑足跡圖仍分布均勻，保證光源的高耦合效率，避免人為裝調等因素對光傳輸系統耦合效率及檢測系統穩定性的影響。

4 基于改進EMD的光譜信號去噪方法

在生物分子間相互作用的干涉光譜信號采集過程中，檢測系統內部和外部都存在噪聲源，使得實際采集的原始干涉光譜信號曲線存在嚴重的系統高頻噪聲干擾。這些高頻噪聲主要來源于環境雜散光噪聲、分光光度計內線陣CCD和數據采集系統電路的電噪聲，基本屬于隨機噪聲。在后續數據處理部分假設直接分析干涉信號的光譜信息，會出現相對較大的誤差。因此，需要根據噪聲特點，采取相應的處理方法，盡可能簡單地剔除噪聲干擾，改善數據的平滑程度，從而提高信號的信噪比。目前常用的信號去噪方法主要有小波變換信號去噪法以及經驗模態分解(EMD)法，采用小波分析等傳統濾波方法對干涉光譜信號進行處理，會出現較大的干涉光譜極值點偏移問題；經驗模態分解(EMD)方法是處理非線性、非平穩信號的時頻分析方法。該方法可以在未知任何先驗知識的情況下，依據輸入信號自身的特點，自適應的將信號分解成若干個本征模態函數(Intrinsic Mode Function,IMF)之和[12-13]。EMD被認為是對以線性和平穩假設為基礎的傅立葉分析和小波變換等傳統時頻分析方法的重大突破。采用經驗模態分解(EMD)方法進行干涉光譜信號處理，不需要預先設置任何參數，具有完全數據自主驅動的特點，適合于分析非線性、非平穩信號序列，具有很高的信噪比[14～16]。但在高頻分量中存在低頻混疊的問題，因此本文采用一種EMD干涉光譜信號處理的改進方法，即針對干涉光譜信號的高頻噪聲特點，對一次EMD干涉光譜信號處理后的高頻IMF分量做二次EMD處理，以彌補一次EMD處理重構后信號的相位微漂移，實現更精細尺度下的頻率成分分析，提高干涉光譜數據極值點的提取精度，該算法步驟如圖8所示。

圖8 干涉光譜信號二次EMD改進方法處理流程圖 Fig.8 Flowchart of improved method of two times EMD for interference spectrum signal

圖9 原始干涉光譜經EMD改進方法分析處理后的各階分量 Fig.9 Each order components of original interference spectrum processed by the improved EMD method

圖10 含有噪聲的原始干涉光譜曲線 Fig.10 Original spectral curve with noise interference

對第一次EMD處理后舍棄的高頻分量進行二次EMD篩選，結果如圖9所示，其中3階以后的分量變化平緩，再利用相關系數評價法，對相關系數較小的分量進行重構，獲得近似的直流分量。將獲得的直流分量與第一次EMD處理所重構的分量相加，獲得干涉光譜信號的濾波結果，從物理概念來看，兩次EMD處理結果可以有效的保持原干涉光譜信號的低頻分量，充分利用EMD的多分辨率分解，對高頻噪聲實現有效去除，保證干涉光譜信號相位處理后的一致性。

兩次EMD濾波處理結果如圖11所示，是對單次處理的相位微調并進行局部放大，與其它小波分析、中值濾波與Savitzky-Golay平滑濾波等傳統光譜濾波方法相比較，干涉光譜信號的EMD改進分析方法可以實現實時性，不需輸入其它參數，完全是數據自主驅動，在相位的保持上也優于傳統濾波方法。

圖11 EMD改進方法去噪結果 Fig.11 Denoising results of improved EMD method(a) and the partial enlargement result(b)

5 實驗結果與分析

本文采用上述搭建的光干涉生物親和性傳感檢測系統(如圖12所示)，建立了金納米粒子信號放大HER3-IgG1抗體藥定量檢測新方法。HER家族是跨膜酪氨酸激酶受體(RTK)，是細胞增殖、分化、存活、移動等重要調節者，與多種人類癌癥的形成與發展有關，在乳腺癌病人中HER3陽性患者占41.8%，針對HER3靶標的抗體藥物研發成為熱點。

圖12 生物親和性檢測系統 Fig.12 Photo of bioaffinity detection system

圖13 HER3-IgG1定量檢測結合反應曲線 Fig.13 Quantitative detection with reaction curves of HER3-IgG1

圖14 HER3-IgG1定量檢測標準曲線 Fig.14 Standard curve of quantitative detection of HER3-IgG1

實驗將光纖探針表面固定Biotin-HER3抗原，然后與人源化HER3-IgG1抗體藥進行結合反應，響應值與抗體藥濃度呈正相關。檢測系統實時監測相互作用過程如圖13所示，其中a～i是光纖探針檢測29.440～0.115 μg/mL濃度范圍內倍比稀釋HER3-IgG1，經Mc Ab-Au信號放大后的反應曲線；j是固定有Biotin-HER3抗原的光纖探針置于20%兔血清中，經同濃度Mc Ab-Au信號放大的空白對照反應曲線。各濃度均重復3次測定，HER3-IgG1定量檢測標準曲線如圖14所示，在0.115～29.440 μg/mL濃度范圍內，標準曲線符合Logistic曲線擬合，相關系數R2=0.997，檢測時間17 min。空白對照組重復3次檢測的SD(n=3)為0.132，檢測限(LOD)為空白對照3倍SD對應的HER3-IgG1濃度，經實驗結果為0.082 6 μg/mL；定量限(LOQ)為空白對照10倍SD對應的HER3-IgG1濃度，經實驗結果為0.267 μg/mL。

其中，檢測限指樣品中的待測物質能夠被檢測出的最低濃度，也就是能測出該物質的最低濃度；定量限指樣品中待測物質能夠被測定的最低濃度，即能夠準確定量檢測出該物質的最低濃度；SD表示對空白進行測定，其測定結果的標準偏差，是一種量度數據分布的分散程度的標準，用以衡量數據值偏離算數平均值的程度，標準偏差越小，檢測值偏離平均值就越少，反之就越多。

6 結 論

本文根據光干涉生物親和性傳感檢測系統的原理分析，以ZEMAX光學設計軟件為前提，設計了自聚焦透鏡與光纖探針耦合的光干涉生物親和性傳感檢測光學傳輸系統，有效提高光源耦合效率，降低人為裝調帶入的偏心與傾斜問題對系統穩定性的影響；然后采用一種EMD干涉光譜信號處理改進方法去除干涉光譜信號的噪聲干擾，提高信號采集精度。采用搭建的光干涉生物親和性傳感檢測系統，實現了HER3抗原與HER3-IgG1抗體藥特異性相互作用過程的實時監測，引入金納米粒子偶聯第二抗體信號放大效應，建立了HER3-IgG1抗體藥的定量檢測新方法，利用所搭建的光干涉生物親和性檢測系統，實現了對HER3-IgG1抗體藥物含量的定量檢測新方法。實驗結果表明系統檢測限能達到0.082 6 μg/mL，能夠應用于藥代動力學的研究中。

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