苦參素對(duì)大鼠急性腦缺血再灌注后血液流變學(xué)指標(biāo)的影響*

韓亞非 余 婷

（1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；2.河北省邯鄲市中醫(yī)院，河北 邯鄲 056001）

隨著人口老齡化的加劇，缺血性腦血管病已逐漸發(fā)展成為致殘和死亡的主要疾病之一，盡快通過(guò)藥物溶栓或介入治療以恢復(fù)血流再灌注是挽救患者生命、降低血栓后遺癥的首要治療方案，但缺血再灌注并發(fā)癥的存在卻嚴(yán)重影響著其治療效果。缺血再灌注損傷病理機(jī)制非常復(fù)雜，其中血液流變學(xué)指標(biāo)改變是其重要的病理機(jī)制之一［1-2］。苦參素（Oxymatrine）為傳統(tǒng)中藥品種苦參的主要有效成分之一，既往研究發(fā)現(xiàn)苦參素能夠通過(guò)抑制繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)等而對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用［3-4］，但關(guān)于苦參素能否改善腦缺血再灌注后血液流變學(xué)指標(biāo)的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見(jiàn)。銀杏葉提取物能夠通過(guò)擴(kuò)張腦血管、改善血液流變學(xué)指標(biāo)而對(duì)腦組織缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用［5］。本研究將以銀杏葉提取物為陽(yáng)性對(duì)照藥物，通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)研究苦參素對(duì)腦缺血再灌注后血液流變學(xué)指標(biāo)的影響并探討其可能的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用SD大鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)［SCXK（冀）2013-1-003］，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。雌雄各半，體質(zhì)量250～300 g，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫 23～25℃、相對(duì)濕度 65%～70%、光照周期12 h∶12 h，健康狀況良好，均斷頭處死。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 試藥與儀器

苦參素購(gòu)自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司 （批號(hào)20170114）；銀杏葉提取物購(gòu)自中豪國(guó)際有限公司（規(guī)格：17.5 mg∶5 mL， 批號(hào)：1608019）；HE 試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：161209）；TTC購(gòu)自上海化學(xué)試劑公司 （批號(hào)：161209）；超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：20170309、20170413、20170114）。iMark 型酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）；UV-1206型紫外分光光度計(jì)（日本SHIMODZU）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.3 造模與分組

參照文獻(xiàn)［5］，取168只試驗(yàn)用大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，苦參素低［25 mg/（kg·d）］、中［50 mg/（kg·d）］、高［100 mg/（kg·d）］劑量組和銀杏葉提取物50 mg/（kg·d）組，每組28只。通過(guò)線(xiàn)栓法阻斷大腦中動(dòng)脈制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，假手術(shù)組行手術(shù)操作但不插入栓線(xiàn)。

1.4 干預(yù)方法

參照文獻(xiàn)［6］，精確稱(chēng)取苦參素加入0.9%氯化鈉注射液依次配置濃度為25、12.5、50 mg/mL的苦參素溶液；精確稱(chēng)取銀杏葉提取物，加入適量0.9%氯化鈉注射液配置質(zhì)量濃度為25 mg/mL的銀杏葉提取物溶液。各組均于術(shù)后第2日開(kāi)始腹腔注射給藥，療程7 d。假手術(shù)組和模型組同步腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉注射液 2 mL/（kg·d），療程 7 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè)

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)分 參照文獻(xiàn)［7］采用10分制盲法評(píng)分：置地上，向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)1分；提鼠尾，缺血對(duì)側(cè)前肢腕屈曲計(jì)1分、肘屈曲計(jì)2分、肩內(nèi)旋計(jì)3分；對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降，據(jù)下降程度計(jì)1～3分；置金屬網(wǎng)上，據(jù)缺血對(duì)側(cè)肌張力下降程度計(jì)1～3分。

1.5.2 腦組織含水量和梗死體積 每組隨機(jī)選取6只大鼠，深度麻醉后斷頭并剝?nèi)∧X組織，去除小腦和低位腦干后稱(chēng)大腦組織質(zhì)量（W），110℃恒溫烘烤48 h后稱(chēng)重（D），腦組織含水量計(jì)算公式：腦含水量（%）=［（W-D）/W］×100%。 每組另隨機(jī)取 6只大鼠，深度麻醉后斷頭取腦，置于-20℃冷凍15 min后沿冠狀切片（厚度約2 mm），于2%的TTC染色液中避光孵育0.5 h（梗死區(qū)呈蒼白色），運(yùn)用圖像分析軟件計(jì)算大腦組織梗死百分比。

1.5.3 腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu) 各組隨機(jī)取6只大鼠，參照“1.5.2”項(xiàng)下方法取大腦、多聚甲醛溶液（濃度4%）固定3 d、石蠟包埋、切片、脫蠟水化，然后行常規(guī)蘇木精-尹紅（HE）染色，封片后通過(guò)顯微鏡觀察腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5.4 抗氧化酶活性和MDA含量 各組取剩余10只大鼠，參照“1.5.2”項(xiàng)下方法取大鼠大腦并剝?nèi)『ｑR組織，研磨勻漿，3000 r/min離心10 min取上清液，遵照試劑盒步驟處理后通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定抗氧化酶（SOD、CAT）活性和MDA含量。

1.5.5 血液流變學(xué)指標(biāo)及紅細(xì)胞膜流動(dòng)性指標(biāo) 于斷頭取腦前，開(kāi)腹并經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，做抗凝處理，用R-80錐板型血液流變檢測(cè)儀測(cè)定全血黏度（低切、中切、高切）和血漿黏度，計(jì)算紅細(xì)胞聚集指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)、紅細(xì)胞剛性指數(shù)、紅細(xì)胞壓積，測(cè)定血沉。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及梗死體積比較

見(jiàn)表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量和梗死體積均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，苦參素中、高劑量組和銀杏葉提取物組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量和梗死體積顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），上述苦參素作用具有一定的劑量依賴(lài)性；苦參素高劑量組與銀杏葉提取物組比較，各指標(biāo)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積比較（±s）

與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

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2.2 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

見(jiàn)圖1。假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元層次清晰，排列整齊，形態(tài)完整，核膜、核仁清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元呈現(xiàn)層次紊亂，排列稀疏、間隙增大、數(shù)量減少，胞體腫脹變形，胞核固縮或溶解等形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變；與模型組比較，苦參素各劑量組和銀杏葉提取物組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變呈不同程度改善，該效果以苦參素高劑量組最為顯著。

圖1 各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠腦組織抗氧化酶活性和MDA含量

見(jiàn)表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織抗氧化酶（SOD、CAT）活性顯著降低且MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，苦參素中、高劑量組與銀杏葉提取物組大鼠海馬組織SOD、CAT活性顯著提高且MDA含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；上述苦參素作用具有一定的劑量依賴(lài)性；苦參素高劑量組與銀杏葉提取物組比較，各指標(biāo)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠全血黏度、血漿黏度比較

見(jiàn)表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠全血黏度低、中、高切均顯著升高（P＜0.05），血漿黏度顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，苦參素中、高劑量組和銀杏葉提取物組大鼠全血黏度低、中、高切及血漿黏度均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；苦參素上述藥理學(xué)作用具有一定的劑量依賴(lài)性；苦參素高劑量組與銀杏葉提取物組比較，各指標(biāo)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量比較（±s）

表2 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量比較（±s）

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表 3 各組大鼠全血黏度、血漿黏度比較（mPa·s，±s）

表 3 各組大鼠全血黏度、血漿黏度比較（mPa·s，±s）

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2.5 各組大鼠紅細(xì)胞膜流動(dòng)性指標(biāo)比較

見(jiàn)表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），紅細(xì)胞變形指數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，苦參素中、高劑量組和銀杏葉提取物組大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)并顯著升高紅細(xì)胞變形指數(shù)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；苦參素上述藥理學(xué)作用具有一定的劑量依賴(lài)性；苦參素高劑量組與銀杏葉提取物組比較，各指標(biāo)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)、變形指數(shù)比較（±s）

表4 各組大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)、變形指數(shù)比較（±s）

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2.6 各組大鼠紅細(xì)胞壓積、血沉比較

見(jiàn)表5。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠紅細(xì)胞壓積、血沉顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，苦參素中、高劑量組和銀杏葉提取物組大鼠紅細(xì)胞壓積和血沉均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；苦參素上述藥理學(xué)作用具有一定的劑量依賴(lài)性；苦參素高劑量組與銀杏葉提取物組比較，各指標(biāo)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠紅細(xì)胞壓積、血沉比較（±s）

表5 各組大鼠紅細(xì)胞壓積、血沉比較（±s）

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3 討 論

缺血再灌注損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響缺血性腦病患者治療效果，其病理機(jī)制非常復(fù)雜，既往病理研究發(fā)現(xiàn)急性缺血性腦病患者血液黏度增高，呈濃、黏、凝、聚狀態(tài)［8-9］，血液流變學(xué)指標(biāo)均顯著高于正常對(duì)照組，表現(xiàn)出紅細(xì)胞變形能力下降、聚集程度升高以及血液黏度提高等指標(biāo)變化［10］，血液高凝狀態(tài)將導(dǎo)致局部血液微循環(huán)持續(xù)惡化，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞繼發(fā)性凋亡，為缺血再灌注損傷的重要病理機(jī)制之一。因此，通過(guò)改善血液流變學(xué)指標(biāo)以預(yù)防梗死灶進(jìn)一步擴(kuò)大和二次腦梗或許是提高急性缺血性腦病患者臨床療效有效方案。

苦參（Sophora flavescens Ait.）為豆科苦參屬多年生落葉亞灌木植物苦參的根，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥品種之一，《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》等均有記載。近代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)苦參素是苦參的主要有效成分之一，具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)活性［11-12］以及擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)等藥理學(xué)作用［13］，既往研究發(fā)現(xiàn)苦參素能夠通過(guò)改善血液流變學(xué)指標(biāo)而改善心肌功能［14］，但苦參素是否能夠改善腦缺血再灌注后血液流變學(xué)指標(biāo)而起到一定保護(hù)作用的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備局灶性腦缺血再灌注大鼠模型并腹腔注射給予苦參素進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)苦參素 50～100 mg/（kg·d）治療能夠有效降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、改善神經(jīng)功能癥狀，降低腦組織含水量，降低腦組織梗死體積，抑制腦組織海馬CA1區(qū)病變，改善海馬CA1區(qū)抗氧化酶活性（SOD、CAT）并降低 MDA 含量［15-16］、降低氧化應(yīng)激損傷，苦參素上述作用具有一定的劑量依賴(lài)性，并且苦參素100 mg/（kg·d）組上述藥理學(xué)作用與陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)顯著差異，提示苦參素對(duì)腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

血液流變學(xué)指標(biāo)正常對(duì)機(jī)體組織血液灌注尤其是維持局部血液微循環(huán)非常重要，血液流變學(xué)受多方面因素影響，其中全血黏度、血漿黏度，紅細(xì)胞聚集指數(shù)、變形指數(shù)、剛性指數(shù)等發(fā)揮著重要作用，此外紅細(xì)胞膜流動(dòng)性指標(biāo)對(duì)血液流變學(xué)也具有一定影響［17-19］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)苦參素干預(yù)治療能夠顯著降低腦缺血再灌注大鼠全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度以及血漿黏度，降低紅細(xì)胞聚集指數(shù)、剛性指數(shù)并提高紅細(xì)胞變性指數(shù)，減低紅細(xì)胞壓積和血沉，苦參素上述作用具有一定的劑量依賴(lài)性，并且苦參素100 mg/（kg·d）組上述藥理學(xué)作用與銀杏葉提取物50 mg/（kg·d）組無(wú)顯著差異，提示苦參素具有改善腦缺血再灌注損傷大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)、血液高凝狀態(tài)、局部微循環(huán)的作用。

總之，苦參素可能通過(guò)改善血液流變學(xué)指標(biāo)而對(duì)腦缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用。

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