ICG納米探針在早期結腸癌診斷中的應用及其價值

劉志超，屈亞威，劉海峰

結腸癌(colon cancer，CC)是常見的消化系統惡性腫瘤之一，近年來結直腸癌新增和死亡率已躍升至國內全部癌癥中的第五位[1]。目前，結腸癌及癌前病變的臨床早期診斷主要依靠消化道內鏡檢查和活檢病理診斷，由于多數早癌形態結構變化不明顯且病變活檢定位隨機性高，因此傳統的早期診斷方法存在準確性低、靈敏度低、漏診率高的不足。隨著熒光分子成像(fluorescence molecular imaging，FLI)技術的快速發展，使得內鏡下分子成像輔助診斷成為消化道腫瘤早期診斷、篩查研究的熱點，此方法不僅漏診率低，還能夠對腫瘤進行精準的靶向治療[2]，因此有望成為早期結腸癌診斷的新手段。本研究旨在探討利用組織穿透性較高的近紅外[3]熒光染料吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)標記人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的納米探針HSA-ICG，在結腸癌分子成像中的靶向性和熒光效應，為研發應用于實際臨床診斷與治療的結腸癌熒光分子探針打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 活體熒光成像儀(IVIS，Xenogen公司)；980 nm近紅外激光器，購自長春市海洋光電有限公司；Cell DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自GiBCO公司。結腸癌細胞HCT116(軍事科學院軍事醫學研究院)；BALB/C裸鼠，SPF級，雌性，4～6周齡，18～22 g，飼養于無菌獨立通風籠盒中，小鼠飼養房室內溫度保持在 25 ℃左右，空氣相對濕度保持在40%～70%，用專門為小鼠配制的消毒飼料、純凈水飼喂。每3天更換墊料、食物和水。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將HCT116結腸癌細胞接種于提前配置好的細胞培養液中，置于培養箱，37 ℃，5% CO2培養24～48 h,觀察細胞貼壁情況，貼壁達70%～80%后，倒掉培養液，放入25 ml的培養瓶中，向培養瓶中加入2～3 ml胰蛋白酶，充分混勻，邊消化邊取少量細胞懸液在倒置顯微鏡下觀察，當鏡下細胞收回突起變圓或細胞間隙增大時停止消化。吸出消化液，加入少量細胞培養液，反復吹打使細胞脫壁形成懸液。將懸液倒入離心管，再離心1000 r/min，5 min，離心后，倒掉上清液，加入少量DMEM培養液重懸。根據細胞數量進行1∶2-1∶3傳代，將細胞懸液倒入松瓶口置于培養箱(37 ℃，5% CO2)。

1.2.2 建立裸鼠結腸癌皮下移植瘤模型 用2.5 g/L的胰酶消化處于生長期的HCT116細胞，離心(1000 r/min，5 min)，加入PBS緩沖液形成重懸液，通過細胞計數得到細胞數為 2×107/ml。使用75%乙醇消毒裸鼠右側肩部部位，皮下注射0.2 ml細胞懸液，待腫瘤長至0.8～1.0 cm時備用，定期更換小鼠墊料及食物、水。

1.2.3 裸鼠結腸癌皮下移植瘤活體熒光分子成像

1.2.3.1 FolateRsenseTM680探針的FLI 根據特異性熒光分子探針及免疫組化的相關文獻報道[4，5]，本實驗選用葉酸受體α[6，7](Folate receptor，FRα)作為目標靶點，并選擇其相對應的商業化特異性熒光分子探針FolateRsenseTM680，對裸鼠HCT116皮下移植瘤模型進行熒光分子成像。

在IVC籠盒中隨機選取3只成功構建HCT116結腸癌皮下腫瘤模型的裸鼠，注射探針前吸入異氟烷麻醉后均經尾靜脈注射100 μl的FolateRsenseTM680，并于注射前、注射后1、3、7、24、48 h使用IVIS進行FLI。用IVIS Spectrum系統分析，ROI為以成腫瘤部位為中心，直徑為10 mm的圓形區域，測量各時間點ROI的平均熒光信號強度。

1.2.3.2 注射HSA-ICG納米探針的裸鼠FLI 隨機選取同一批建模成功的3只裸鼠，尾靜脈注射相應HSA-ICG探針200 μg/200 μl。并于注射前、注射后1、3、7、24、48 h使用IVIS進行FLI。探針注射后同樣進行FLI。用IVIS Spectrum系統分析，ROI為以成腫瘤部位為中心，直徑為10 mm的圓形區域，測量各時間點的ROI平均熒光信號強度。

1.2.3.3 注射ICG探針的裸鼠FLI 隨機選取同一批建模成功的3只裸鼠，尾靜脈注射相應ICG探針200 μg/200 μl。并于注射前、注射后1、3、7、24、48 h使用IVIS進行FLI。探針注射后同樣進行FLI。用IVIS Spectrum系統分析，ROI為以成腫瘤部位為中心，直徑為10 mm的圓形區域，測量各時間點ROI的平均熒光信號強度。

2 結 果

兩種探針注射后分別進行FLI，結果顯示與對照探針ICG相比，商用的熒光探針及構建的HSA-ICG納米探針在裸鼠結腸癌皮下移植瘤模型中均有較強的熒光信號，且信噪比好。FolateRsenseTM680及HSA-ICG在裸鼠肝癌皮下移植瘤模型中濃聚高峰時間分別為1 h及24 h(圖1、2、3)，且平均熒光信號均比ICG強。而作為對照的ICG主要在肝臟部位聚集，故肝臟信號特別強，腫瘤部位無特別明顯的腫瘤聚集(圖4)。ICG主要通過肝臟代謝排出體外，故ICG在肝臟部位聚集最多。說明HSA-ICG能夠達到結腸癌腫瘤熒光標記診斷作用。

圖1 注射HSA-ICG后結腸癌裸鼠移植瘤模型活體FLI圖

圖2 注射FolateRsenseTM680后結腸癌裸鼠移植瘤模型活體FLI圖

圖3 結腸癌裸鼠兩種特異性熒光探針與ICG對照的平均熒光信號強度隨時間變化圖

圖4 注射ICG后結腸癌裸鼠移植瘤模型活體FLI圖

3 討 論

早期結腸癌手術后5年存活率高達90%，而晚期存活率僅為17%[8]，可見，早診斷、早治療可大幅度提高消化道腫瘤患者的生存質量和存活率。為實現臨床腫瘤的早期、精準診斷，進一步降低腫瘤患者的病死率，結合納米醫學與分子影像技術的早期微創診斷技術已成為臨床研究探索的熱門方向之一。

納米熒光探針主要有無機納米探針和有機納米探針兩類[9]，目前研究較多的無機納米探針材料主要有納米金、熒光納米碳、發光量子點、磁性納米顆粒及硫化銅等[10-12]，但大多無機材料并不是生物體內天然存在的物質，降解和代謝相對較難，限制了其在臨床中的應用[13，14]。常見的有機納米探針材料主要是有機近紅外染料[15]、卟啉脂質體[16]和高分子聚合物及循環腫瘤細胞、基質金屬酶、單克隆抗體等[17-19]。有機納米材料細胞毒性低、生物安全性好，其中近紅外染料可隨尿液排出體外；聚苯胺、聚吡咯等有機探針雖然不易降解，但也不會溶解并釋放出有毒元素[20]。余祖紅等[21]將腫瘤的標志物基質金屬蛋白酶[22](MMPs)與熒光材料偶聯制備成MMP-2/9探針，該探針對結腸癌細胞的檢測率高達95%以上，充分證明了聚合物探針具有較強的特異性、靈敏度。有機納米探針具有良好的應用前景，但仍需要解決一些問題如成像深度淺、穩定性差、易受自體熒光干擾、潛在毒性研究不透徹等。

目前，既能保證人體安全，又能用于腫瘤的早期診斷、治療而被批準用于臨床的近紅外成像試劑只有吲哚菁綠(ICG)[23，24]。ICG具有兩親性結構、近紅外吸收特性和發射熒光特性，既能溶于水又能溶于油脂，可在深層組織中吸收近紅外光，易于標記和跟蹤，但ICG本身具有穩定性不高、濃度聚集、體內的清除快及靶向性差等缺點。為避免ICG在體內的分解和清除，提高探針的穩定性和靶向性，利用蛋白質的生物相容性強、表面的活性基團便于功能性修飾、可與某些近紅外光譜染料產生共價或非共價相互作用的特性[25]，筆者以蛋白質為載體，將ICG制備成聚合物近紅外熒光納米探針，通過分子影像技術靶向標記腫瘤。

HSA是一種生物內源性蛋白質，無毒、無免疫原性，可與許多外源性物質有機結合，是探針顆粒和靶向藥物的理想載體。本研究對實驗裸鼠結腸癌皮下移植瘤模型分別尾靜脈注射HSA-ICG、FolateRsenseTM680、ICG，結果表明，商用的熒光探針及HSA-ICG納米探針在裸鼠結腸癌皮下移植瘤模型中均有較強的熒光信號，且信噪比好。FolateRsenseTM680及HSA-ICG在裸鼠肝癌皮下移植瘤模型中濃聚高峰時間分別為1 h及24 h。將ICG進行HSA的修飾后并進行納米顆粒化，能將ICG的粒徑變小，使其通過腫瘤時產生EPR效應，從而在腫瘤部位實現特異性聚集，產生腫瘤靶向性。故本實驗證明了HSA-ICG納米探針對結腸癌的靶向性與商用的FolateRsenseTM680相當，具有很好的光學檢測結腸癌腫瘤的能力。

HSA-ICG診斷原理簡單成熟、質量可控、安全高效，為結腸癌的早期診斷提供了新的思路，但真正應用于臨床還需進一步分析其在生物組織細胞、臟器層面及整個機體之間的運行機制和潛在毒性。由于臨床對腫瘤診斷與治療的期望值越來越高，納米探針在結腸癌早期診斷的應用正在不斷走向完善，隨著納米技術的迅猛發展，將來還會有更多、更加穩定、更加安全有效的納米探針應用于腫瘤的臨床診斷，甚至可能研發出集藥物傳輸、控釋，靶向標記、跟蹤為一體的多功能診療一體化探針。

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