負壓創面療法治療豬銅綠假單胞菌感染創面的效果

王國旗，唐佩福

創面污染能否導致感染形成常取決于致病菌的類型和數量，一般創面軟組織內細菌數量達到105CFU/g (tissue)即可認為達到臨床感染標準[1,2]。因此，減少或殺滅軟組織內的細菌是治療軟組組感染的重要目標，也是用來衡量軟組織感染治療狀況的重要指標之一。負壓創面療法 (negative pressure wound therapy, NPWT)在嚴重開放性骨折創面、糖尿病足潰瘍、下肢靜脈潰瘍等治療方面已經得到廣泛應用[3-7]。近年來，眾多研究相繼報道NPWT在感染性創面的應用，發現其可以減輕創面感染程度，加速創面愈合[8-11]。然而，目前報道NPWT治療下銅綠假單胞菌感染創面生物膜變化、生物膜成分改變，以及細菌在軟組織內的侵襲深度的研究較少。

1 材料與方法

1.1 巴馬香豬軟組織感染模型 巴馬香豬24只，術前適應性飼養1周。經過麻醉、脫毛及消毒，在巴馬香豬背部建立一個直徑5 cm深達肌肉層的軟組織創面，去除肌肉腱膜，充分止血后接種0.5 ml表達綠色熒光蛋白的銅綠假單胞菌菌液(總菌量為5×107CFU)，涂抹均勻，半透明膜敷料覆蓋24 h，以確保細菌的穩定黏附和定植。本研究經過我院動物倫理委員會審查。

半透明膜敷料覆蓋24 h后(建模成功)將巴馬香豬隨機分為NPWT組(負壓組)和無菌紗布治療組(對照組)，每組12只，分別進行治療。密切觀察敷料變化情況，每兩天更換敷料1次。分別于治療的第4、8、12、16天取材。

1.2 軟組織內細菌計數 將標本稱重并記錄。首先用無菌組織剪充分剪碎組織標本，按照組織標本與無菌PBS緩沖液的重量比為1∶99的比例混合，于研磨器中再次充分研磨。依照倍比稀釋法按濃度梯度稀釋，最后分別吸取100 μl稀釋液均勻涂抹于LB固體培養液，37 ℃培養24 h后計數。選取LB固體培養液細菌計數在30～300個作為統計數據，每一個濃度梯度涂抹重復3次，取平均值，最終軟組織內細菌計數單位為CFU/g tissue。

1.3 生物膜成分eDNA定量分析 取創面敷料1 g，置于離心管中，加入無菌1 ml PBS緩沖液，渦旋震蕩3 min，充分洗脫敷料上的細菌及生物膜[12,13]。4 ℃， 13 400 g條件下高速離心，去除不溶性物質，取100 μl上清液，用微量樣品DNA提取試劑盒抽提其中的eDNA，具體提取過程依據試劑說明書。采用Qubit? 2.0核酸蛋白定量儀測定DNA濃度，最終每個創面eDNA濃度單位為μg/ml。

1.4 細菌侵襲深度檢測 取巴馬香豬肌肉組織標本。冷凍切片機內切取標本，注意標記標本的創面一側。激光共聚焦顯微鏡觀察，使用自帶軟件測量細菌從表面侵襲至最深處的深度并記錄。每組隨機選取6張，取每一張切片內細菌侵襲深度最深的值作為統計數據。圖形制作軟件采用Graphpad prism 5.0。

2 結 果

2.1 細菌計數 模型建立成功，負壓組和對照組細菌計數均在107CFU/g tissue左右。在治療后的第8天負壓組軟組織內細菌計數明顯低于對照組，差異有統計學意義，其中負壓組細菌計數達臨床感染標準105CFU/g 組織左右，而在治療的第16天兩組細菌計數均低于臨床感染標準，分別為10～104CFU/g組織和102～105CFU/g組織(圖1)。

圖1 巴馬香豬銅綠假單胞菌感染不同方法治療后

2.2 eDNA分析 治療后第4天創面生物膜成分eDNA定量檢測顯示負壓組與對照組含量分別為(1.61±0.20)μg /ml和(1.82±0.28)μg /ml，差異開始有統計學意義(P<0.01)，在治療的第8、12、16天負壓組eDNA水平均明顯低于對照組(P<0.01, 圖2)。

圖2 巴馬香豬銅綠假單胞菌感染不同方法治療后軟組織創面eDNA對比

治療的第4，8，12，16天負壓組eDNA水平明顯低于對照組，①P<0.05；②P<0.01

2.3 細菌侵襲深度分析 建模成功后(day 0)負壓組和對照組細菌平均侵襲深度分別為(221.7±22.4)μm和(218.5±31.0)μm，細菌侵襲深度示意圖見3。隨著治療時間的延長，兩組創面細菌平均侵襲深度均逐漸減少。但負壓組細菌侵襲深度在治療的第4、8、12、16天明顯低于對照組(P<0.05，圖4)。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下銅綠假單胞菌在巴馬香豬軟組織內的侵襲深度

圖4 兩組巴馬香豬銅綠假單胞菌在軟組織內侵襲深度對比

治療的第4、8、12、16天兩組細菌侵襲深度差異有統計學意義，①P<0.05；②P<0.01

3 討 論

創面軟組織內細菌數量一定程度上決定了感染的程度。早前研究多數致力于探討NPWT治療下創面細菌數量的變化，然而未見研究報道NPWT可以將創面軟組織內細菌降至臨床感染標準以下(105CFU/g)，這可能與觀察時間不夠長有關，因為早前研究多數觀察至治療后1周左右[figure_title14,15]。本研究采用巴馬香豬軟組織感染模型對NPWT進行探索，并觀察至治療的第16天。在觀察至第12天時實驗組細菌計數已低于臨床感染標準，在觀察至第16天時兩組細菌計數均低于臨床感染標準，但此時實驗組細菌計數已達103CFU/g tissue以下。而創面細菌數量的降低的原因可能是以下兩方面，首先是NPWT的持續引流作用，其次是創面eDNA的減少致使細菌失去了一定的保護作用。早前研究報道eDNA是細菌生物膜的重要組成部分[16-18]，而eDNA成分也能夠支持銅綠假單胞菌的黏附作用[19,20]。而本研究中生物膜的關鍵成分eDNA定量檢測顯示實驗組在治療后創面eDNA的濃度明顯低于對照組，這說明NPWT可以在治療早期降低創面銅綠假單胞菌生物膜的關鍵成分。

細菌在軟組織內侵襲的深度決定了感染的深度，也決定了細菌在創面的哪一個層面定植、增殖。目前，未見報道負壓環境下創面細菌侵襲深度的相關研究。本研究采用激光共聚焦顯微鏡觀察細菌侵襲深度，結果顯示NPWT治療下銅綠假單胞菌軟組織內侵襲深度明顯低于對照組，這可能有兩方面原因，第一是得益于NPWT的負壓作用，在負壓的作用下海綿與創面軟組織貼附緊密并且不斷吸引，而此時的軟組織如果是在海綿的孔內則受到負壓引流作用，如果是與海綿貼附那么軟組織則受到壓力作用，無論是壓力作用還是引流作用可能都不利于細菌的進一步深度侵襲；第二可能是NPWT可以減少生物膜重要成分eDNA，阻礙細菌在創面的穩定黏附和定植，在這種情況下，同時感染所致的壞死物質會被及時引流，創面上缺少了保護細菌的污物，此時細菌可能直接面對創面組織細胞和免疫細胞，這可能會加大機體免疫對細菌的清除作用，也避免了細菌對創面的進一步深度侵襲。而常規紗布治療組隨著治療時間的延長細菌侵襲深度也逐漸減小，但其深度均高于負壓組，這也與在治療期間發現對照組創面壞死物質較多相一致。

本研究的不足是僅采用單一細菌做感染模型，而臨床中創面感染多為多重細菌的混合性感染；本研究采取野生型銅綠假單胞菌細菌作為感染菌株，對抗生素較為敏感，臨床感染菌株常為耐藥性，而本研究未對耐藥性菌株進行探索。

綜上所述，NPWT治療銅綠假單胞菌感染性軟組織創面可以清除創面生物膜的重要成分，減少創面細菌數量，尤其是在治療的中后期可以將創面細菌降至臨床感染標準以下，這一速度明顯比常規的無菌紗布治療方法快。本研究為NPWT治療感染性軟組織創面提供了理論基礎。

【參考文獻】

[1] Bowler P G. The 10(5) bacterial growth guideline: reassessing its clinical relevance in wound healing[J]. Ostomy Wound Manage, 2003, 49(1):44-53.

[2] Rennie M Y, Lindvere-Teene L, Tapang K,etal. Point-of-care fluorescence imaging predicts the presence of pathogenic bacteria in wounds: a clinical study[J]. J Wound Care, 2017,26(8):452-460.

[3] Streubel P N, Stinner D J, Obremskey W T. Use of negative-pressure wound therapy in orthopaedic trauma[J]. J Am Acad Orthop Surg, 2012, 20(9):564-574.

[4] Investigators F, Bhandari M, Jeray K J,etal. A trial of wound irrigation in the initial management of open fracture wounds[J]. N Engl J Med, 2015, 373(27):2629-2641.

[5] Liu X, Zhang H, Cen S,etal. Negative pressure wound therapy versus conventional wound dressings in treatment of open fractures: a systematic review and meta-analysis[J]. Int J Surg, 2018,53:72-79.

[6] Khamaisi M, Balanson S. Dysregulation of wound healing mechanisms in diabetes and the importance of negative pressure wound therapy (NPWT)[J]. Diabetes Metab Res Rev, 2017, 33(7)：289-296.

[7] Arvesen K, Nielsen C B, Fogh K. Accelerated wound healing with combined NPWT and IPC: a case series[J]. Br J Community Nurs, 2017, 22 (Suppl3): S41-S45.

[8] Liu Y, Zhou Q, Wang Y,etal. Negative pressure wound therapy decreases mortality in a murine model of burn-wound sepsis involving Pseudomonas aeruginosa infection[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e90494.

[9] Davis K, Bills J, Barker J,etal. Simultaneous irrigation and negative pressure wound therapy enhances wound healing and reduces wound bioburden in a porcine model[J]. Wound Repair Regen, 2013, 21(6):869-875.

[10] Ali E, Raghuvanshi M. Treatment of open upper limb injuries with infection prevention and negative pressure wound therapy: a systematic review[J]. J Wound Care, 2017, 26(12):712-719.

[11] Li T, Zhang L, Han LI,etal. Early application of negative pressure wound therapy to acute wounds contaminated with Staphylococcus aureus: an effective approach to preventing biofilm formation[J]. Exp Ther Med, 2016, 11(3):769-776.

[12] Watters C, Everett J A, Haley C,etal. Insulin treatment modulates the host immune system to enhance Pseudomonas aeruginosa wound biofilms[J]. Infect Immun, 2014, 82(1):92-100.

[13] Burian M, Rautenberg M, Kohler T,etal. Temporal expression of adhesion factors and activity of global regulators during establishment of Staphylococcus aureus nasal colonization[J]. J Infect Dis, 2010, 201(9): 1414-1421.

[14] Lalliss S J, Stinner D J, Waterman S M,etal. Negative pressure wound therapy reduces pseudomonas wound contamination more than Staphylococcus aureus[J]. J Orthop Trauma, 2010, 24(9): 598-602.

[15] Boone D, Braitman E, Gentics C,etal. Bacterial burden and wound outcomes as influenced by negative pressure wound therapy [J]. Wounds, 2010, 22(2): 32-37.

[16] Whitchurch C B, Tolker-Nielsen T, Ragas P C,etal. Extracellular DNA required for bacterial biofilm formation[J]. Science, 2002, 295(5559): 1487.

[17] Li T, Wang G, Yin P,etal. Effect of negative pressure on growth, secretion and biofilm formation of Staphylococcus aureus[J]. Anton Leeuw, 2015,108(4):907-917.

[18] Sugimoto S, Sato F, Miyakawa R,etal. Broad impact of extracellular DNA on biofilm formation by clinically isolated Methicillin-resistant and -sensitive strains of Staphylococcus aureus[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 2254.

[19] Tang L, Schramm A, Neu T R,etal. Extracellular DNA in adhesion and biofilm formation of four environmental isolates: a quantitative study [J]. FEMS Microbiol Ecol, 2013, 86(3): 394-403.

[20] Okshevsky M, Meyer R L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms [J]. Crit Rev Microbiol, 2015, 41(3): 341-352.