國內首例凝膠基質自體軟骨細胞移植治療膝關節軟骨損傷及文獻回顧

丁 一,鄭靜晨,張仲文

軟骨修復技術是當今骨科和運動醫學的研究熱點。自體軟骨細胞移植(autologous chondrocyte implantation ，ACI)[1,2]等組織工程技術的療效較為確切[3]，因而備受矚目。纖維蛋白凝膠型自體軟骨細胞移植(fibrin matrix-mixed gel-type ACI, G-ACI)是一種新型第三代ACI技術，凝膠基質可支持軟骨細胞的擴增、遷移，構成支架成分，其形成透明樣軟骨的成功率高于傳統ACI技術[4]。G-ACI手術操作便捷，不受缺損部位、形狀、深度所限[5]。目前，G-ACI在歐洲、韓國等地已進入臨床應用階段，短期隨訪療效好[5-7]。本團隊首次在國內開展了G-ACI手術，現將手術技術和短期隨訪結果報告與討論如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 根據國際軟骨修復協會( ICRS) 指南，我科選取1例女性48歲右膝骨軟骨損傷患者作為國內首例在2016-04-18接受G-ACI手術的患者。該患者右膝髕股關節對吻傷，髕骨軟骨大面積缺損, 股骨內髁小部分缺損，均為Outerbridge/ICRS Ⅲ-Ⅳ度。患者簽署了知情同意書，臨床研究按照赫爾辛基宣言和中國倫理進行。

1.2 手術方法

1.2.1 術前準備 膝關節正側位X線片，測量下肢力線和Q角；術前進行MRI檢查和KOOS評分。

1.2.2 關節鏡下活檢 在硬膜外麻醉下施行患膝關節鏡檢查，術中探查半月板，如有病變，則對其進行相應治療。采集患膝非負重區健康關節軟骨約 50 mg，放入培養液，送實驗室(武警總醫院細胞實驗室，GMP標準)分離培養。軟骨細胞培養的標準：細胞數量達到1.2×107/vial，超過活性80%[5]。軟骨組織收集工作需要在二次手術前6周完成。

1.2.3 G-ACI手術 手術在硬膜外麻醉下進行，采用髕旁內側入路顯露膝關節，外翻髕骨后可見髕骨和股骨內髁的缺損區域。刮匙刮除剝脫及病變的軟骨至正常組織，深度達軟骨下骨，修整軟骨缺損創面為近似圓形或橢圓形。為了確保手術效果，用2.5 mm鉆頭在缺損區域制作數個深度5 mm的骨道，將2 ml細胞混懸液(細胞活性85%)，與纖維蛋白、凝血酶通過雙聯注射器注射到缺損部位，5 min后，凝膠硬化[5]，逐層關閉傷口，佩戴支具鎖至0 °，手術時間45 min。

1.2.4 術后康復 術后2周內不能下垂小腿，2周后進行CPM訓練，起始角度60°，至8周增至120°，術后6～8周扶拐下地，術后8～10周脫拐[6]。

1.2.5 隨訪 在術后3、6、12個月進行KOOS 評分，在術后1、3、6、12個月時進行MRI 檢查。所有 MRI 檢查均在武警總醫院核磁共振科完成，采用3.0T MRI進行T1Vibe和T2Mapping掃描。

1.3 評估方法 采用Trattnig標準評估MRI軟骨組織修復情況，包括：(1)缺損部位的填充程度;(2)與周邊軟骨的整合;(3)修復組織的信號強度;(4)軟骨下骨和骨髓的情況。

2 結 果

2.1 一般情況 術前X線片示下肢力線正常，無明顯內外翻。術前MRI示髕骨軟骨損傷軟骨變薄，內髁軟骨損傷，未發現除軟骨損傷之外的疾病。據術中測量，患者右膝髕骨軟骨缺損面積1.8 cm×3.0 cm, 股骨內髁缺損面積0.5 cm×0.5 cm，Outerbridge/ICRS Ⅲ-Ⅳ度損傷(圖1)。

圖1 關節鏡下與二次手術照片

A，D.活檢術中關節鏡下所見，分別示髕骨大范圍軟骨缺損，橫向、深達軟骨下骨，股骨內髁小范圍軟骨缺損，深達軟骨下骨；B，E.二次手術清創后測量髕骨、內髁區域缺損面積；C，F.凝膠注射后，用刮匙探及硬度

2.2 MRI檢查

2.2.1 T2Mapping 患者術后6、12個月和1.5年的T2Mapping MRI顯示，缺損區域的mapping值逐漸降低(圖2)，由術前的71降至40。

圖2 G-ACI術后T2 Mapping MRI 變化

T2Mapping中，成熟的透明軟骨顯示為偏藍色，新生軟骨信號為綠色，黃色和紅色代表變性或損傷；A.患者在G-ACI術前的軟骨T2Mapping信號異常；B.G-ACI術后12個月的Mapping值顯著下降，為不成熟軟骨信號；C.術后1.5年的軟骨信號區趨于正常

2.2.2 T1Vibe MRI示患者術后6個月的T1Vibe MRI顯示髕骨和內髁區域的移植物附著牢固，可見類似新生軟骨的移植物信號，骨髓水腫依然存在；術后12個月，移植區域的軟骨層逐漸增厚，軟骨信號稍顯不均，骨髓水腫減輕；至術后1.5年，髕骨和股骨內髁的缺損已被移植的軟骨細胞填平，軟骨厚度基本恢復正常水平，骨髓水腫信號消失(圖3)。

圖3 術前與術后軟骨缺損處的MRI

Pre O為術前，Po 6 mon為G-ACI術后6個月，Po 1為G-ACI術后12個月，Po 1.5為G-ACI術后1.5年

2.3 KOOS評分 患者術前的KOOS評分是51.4(表1)，而術后6、12個月，1.5年時的KOOS評分各項均呈逐漸增高的趨勢，患者的主觀感受改善最快發生在術后6～12個月，此期間各項指標增幅最大，至術后1.5年KOOS評分已達到79.6分(表1)。在KOOS評分的各項中，改善程度最大的是癥狀方面，程度最小的是日常活動方面。

表1 術前與術后不同時期的KOOS評分對比

3 討 論

G-ACI屬于新研制的第三代ACI技術，以纖維蛋白和凝血酶反應形成的凝膠聚合物為基質，在軟骨損傷部位以注射填充的方式進行自體軟骨細胞移植。纖維蛋白凝膠的生物相容性和生物降解性很好，無毒副作用，近些年來逐漸成為各種軟骨再生技術中的熱門載體[9]。與MACI等常規第三代ACI技術相比，省去了修剪膜片、貼合等復雜步驟，增強了移植物的附著，因此手術暴露更小，可微創操作。纖維蛋白原和凝血酶的比例決定了凝膠的凝固時間[10]，本例凝膠凝固時間為5 min。G-ACI技術中的纖維蛋白凝膠亦構成了負載移植細胞的3D支架，可支持軟骨細胞的擴增、遷移[6,11]。體外培養發現軟骨細胞在纖維蛋白凝膠中培養72 h的細胞活力在90%以上，且依然保持軟骨細胞的表型，其在凝膠支架中均勻分布[6]。通常認為，移植后的軟骨細胞合成細胞外基質的能力與細胞數量有關，更高的細胞數將獲得更優質的軟骨，G-ACI技術可移植1.2×107的細胞，因此理論上講G-ACI比MACI具有更好的療效。動物實驗中，G-ACI形成透明樣軟骨的成功率高于傳統ACI技術[4]，因此G-ACI具有良好的應用前景。近年來，G-ACI技術在歐洲、韓國等地已逐步在臨床中應用于膝、踝關節全層軟骨損傷的治療中，短期隨訪取得了理想的療效[5-7]。韓國一項臨床研究對30位股骨內髁軟骨深層缺損的病例進行G-ACI手術，平均年齡35歲(15～55歲)，軟骨損傷的面積平均為5.8 cm2，術后12個月關節鏡復查見軟骨修復理想，大多恢復至Outerbridge/ICRS Ⅱ級，術后2年的MRI顯示缺損區被新生軟骨填充[11]。據荷蘭科學家報道，對膝關節軟骨平均缺損面積為9 cm2，平均年齡35歲患者的19例患者進行G-ACI手術后的兩年隨訪結果顯示患者的主觀改善效果良好[7]。本次選擇的病例符合既往報道G-ACI適用的范圍，因此推測術后隨訪和臨床療效可預期取得滿意的結果。

3.0 MRI可清晰的顯示移植的軟骨細胞的再生和修復情況[8]。國際軟骨修復學會影像組認為，MRI可獲得質量較好的軟骨影像，FS 3D vibe T1W 是一種用來觀察軟骨的特殊序列，通過增加關節軟骨和軟骨下骨的對比，使軟骨顯示更清晰，有利于觀察和精確評價關節軟骨微小病變，對軟骨損傷具有較高診斷價值[12]。本研究中采用FS 3D vibe T1W序列來評價軟骨修復情況，術后T1Vibe MRI演變清晰的顯示了軟骨再生和修復的動態過程。通常在ACI術后的早期，新生的軟骨細胞不能完全填充缺損區[12]，我們在術后6個月僅能在缺損區觀察到不均勻的新生軟骨信號。至術后12個月，移植的軟骨細胞已基本填滿缺損區，軟骨厚度幾乎恢復到正常水平，提示新生軟骨的形成，同時骨髓水腫減輕，這與本團隊之前的研究結果相一致[12,13]，新生的軟骨信號不均，在適宜的體內環境中，這些軟骨組織將進一步成熟并改建，最終形成成熟的透明樣軟骨。術后1.5年，軟骨厚度已經達到正常水平，信號趨于均勻，骨髓水腫消失，提示相對成熟的軟骨再生。

T2Mapping 即軟骨弛豫時間圖[14]，通過測量軟骨T弛豫時間(T2Mapping 值)，量化各種生理和病理情況下的軟骨信號改變，間接反映軟骨基質含水量、膠原纖維方向和含量、蛋白聚糖含量的改變。目前，T2Mapping已廣泛用于ACI術后，評價新生軟骨的生化性質和軟骨成分與結構的修復情況[14]，T2Mapping中，成熟的透明軟骨含水量少，Mapping值低，顯示為藍色，損傷或變性時，Ⅱ型膠原發生退變，纖維的形態和排列方式改變，對水的通透性增加，同時膠原網架的斷裂使蛋白多糖分散展開，暴露出更多的陰離子, 進一步增加了含水量，導致Mapping值增高，表現為黃色或橙紅色。2例在術后，T2Mapping 值均較之前顯著降低，藍色部分增多、橙紅色部分減少，提示G-ACI術后軟骨組織的修復和改建。由于不同年齡、不同負重部位的Mapping值不同，內髁負重區的值要低于髕骨軟骨，青年人關節軟骨的Mapping值低于中老年人。因此，本例中采用自身前后對照的方法來評價T2Mapping值的變化。患者術前的T2Mapping顯示其軟骨損傷較嚴重，但在術后12個月時其Mapping比之前降低了近30%，同時患者主觀KOOS評分也較術前明顯提高，提示這一階段已經開始了軟骨再生和修復過程。術后1.5年時的Mapping值進一步下降，但仍不屬于正常值范圍，分析其原因可能有以下兩點:(1)患者為中老年，軟骨細胞活力略低于青年個體，因此軟骨修復比較慢；(2)女性患者在ACI術后的主觀評分和MRI表現要明顯低于男性，尤其是有髕骨軟骨損傷的女性患者，其具有更低的主觀評分和MRI表現[15]。

KOOS 評分是一項主觀評分。在患者術后的1.5年之內，其KOOS 評分的各項總體呈升高趨勢，患者較為明顯的主觀改善發生在術后6～12個月期間，此時各項指標分值的增幅最快，其中改善程度最大的是癥狀方面，且患者自述疼痛癥狀好轉明顯，改善程度最小的是日常活動方面，可能是患者主訴的伸膝無力限制活動水平。術后1.5年時所有指標進一步改善，但日常活動方面的改善依然比其他分項低，這可能與文獻報道的女性患者ACI術后主觀評分較低有關[15]。在荷蘭G-ACI術后隨訪兩年的研究中也發現了日常活動方面改善也不明顯的現象[7]。分析其原因可能與軟骨損傷后的恐懼性心理有關，患者由于害怕再次受傷而不愿主動運動，這提示術后針對患者的心理特點進行心理輔導將可能會促進康復進程。

綜上所述，G-ACI是一種新型第三代ACI技術，其操作簡便快捷，不受缺損部位、形狀、深度所限。利用G-ACI技術治療膝關節軟骨缺損的短期療效理想，安全性佳，術后MRI可見軟骨再生和修復，同時患者的主觀評分顯著提高。因此，利用G-ACI技術治療軟骨損傷具有在國內臨床應用的優勢和前景。

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