濕地植物燕子花(Iris laevigata)對模擬施氮的響應研究

曲文靜，喬婭楠，王靈艷，包 宇，盛連喜，唐占輝

(1.東北師范大學環境學院，吉林 長春 130117； 2.東北師范大學國家環境保護濕地生態與植被恢復重點實驗室，吉林 長春 130117；3.武警后勤學院學員二旅，天津 300309)

近年來，由于人類活動的影響，人為釋放的氮素正在各種生態系統中不斷累積，并對生態系統的結構和功能產生顯著影響[1-3].外源氮輸入的增加，造成了生態系統的一系列變化，包括土壤化學性質[4-5]、植物物種組成[6]、植物-土壤系統溫室氣體排放的變化[7-8]，以及凋落物分解[9-10]和生態系統的碳蓄積[11]的改變.氮素不僅是濕地土壤中的主要限制性養分，也是永久性淹水濕地發生富營養化的主要誘因之一[12].濕地土壤中氮素含量的變化及遷移轉化過程，也大大影響了濕地生態系統的結構、功能和濕地的生產力[13-14]，對濕地植物的生長及群落組成具有重要影響[15]，而濕地植物也同時會采取不同的策略以適應氮素變化的濕地環境[16-17].

當植物生長受氮素限制時，適當氮素的增加能刺激植物生長，增加植物生產力、促進植物地上生物量的增加[18].當生態系統處于氮飽和狀態時，即生態系統的氮超出植物生長所需之時，氮的輸入可能就會抑制植物的生長、減少植物生產力，植物的生物量會隨著氮輸入量的增多而顯著下降[19-20].植物的生理生化過程與環境中氮素含量也有很大關聯[21]，特別是葉綠素與光合作用相關酶的合成[22-24]，以及丙二醛(MDA)、可溶性總糖和脯氨酸含量的變化等[25-26].此外，植物繁殖也可以對不同環境變化做出不同的響應[27-28].氮素的增加會引起植物物候的變化，尤其是植物花期[29-30]及繁殖策略方面[31-32]，如Cleland等[30]研究發現氮素添加可以使9個禾本科物種的花期推遲.

近年來，濕地氮素輸入方面的研究主要集中于植物對氮的吸收作用[33]、氮輸入對沼澤濕地溫室氣體的排放影響等方面[34-35]，而天然濕地氮輸入對植物生長、生理特性及繁殖等方面的影響研究相對偏少.吉林省龍灣自然保護區分布有不同演替階段的濕地，其中金川濕地是一典型的泥炭沼澤濕地，周圍分布有大量農田，農業活動過程中，大量氮素可以隨地表徑流進入濕地，這將對該濕地生態系統的植物生長和群落演替造成潛在的影響.燕子花(Irislaevigata)是分布于金川濕地的一種鳶尾屬植物，前期的調查研究表明，它的生長繁殖狀態受濕地環境因子影響很大，相對比較敏感[36].鑒于其為該濕地一種對土壤養分極其敏感的植物物種，本研究選取氮添加這一控制方式，通過模擬控制實驗研究了燕子花的形態、生理和繁殖對氮素的響應，以揭示氮素添加對燕子花的影響機制.研究結果對于濕地保護和濕地生態監測與評價具有一定的參考價值，對燕子花植物種群的保育具有重要的實踐意義.

1 材料和方法

1.1 研究地點

研究地點位于吉林省通化市輝南縣金川鎮(126°23′07.52″E，42°20′57.47″N，海拔624 m)的東北師范大學龍灣濕地生態研究站，該區域屬北溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫4.1℃(1月平均氣溫-15.7℃，7月平均氣溫22.5℃)，年降水量704.2 mm，降水主要集中在7—8月份.

1.2 材料

研究材料為燕子花(IrislaevigataFisch.)，在龍灣自然保護區主要分布于濕地中，花期5—6月，果期7—8月，其他生物學基本屬性詳見文獻[36-37].

1.3 控制實驗方案

設置9個模擬控制單元槽(長、寬、高1.5 m×1 m×0.5 m)，原料為磚砌邊墻、水泥襯里.槽內用燕子花自然分布區(金川泥炭沼澤濕地)的原生土壤填充(土壤總氮含量約為2 kg/m3)，填充厚度為0.3 m.將金川泥炭沼澤濕地自然生長的大小基本一致的燕子花植株移栽到人工控制槽內進行培育，使植株密度與自然生境基本一致(約30株/m2).植株移栽工作在2015年進行，移栽后的燕子花植株經過緩苗后自然生長并越冬，第二年春季進行控制實驗.

共設置3個氮素添加處理(模擬施肥)：0(對照)，5 g/m2(低氮處理)，15 g/m2(高氮處理).氮素控制條件下的水位高度均保持0 水平(與野外自然生境大致相同)，每個處理分配3個單元槽.氮素來源為硝酸銨(NH4NO3)，研究期間間隔20 d分兩次進行添加，方法是將固體NH4NO3溶解于5 L蒸餾水均勻噴灑到人工控制槽的土壤上.

1.3.1 燕子花的形態特征測定

新苗出現后，測定燕子花植株的高度和葉片數量隨時間的變化情況(每個處理30株).在生長末期，收獲每個處理條件下各30株標記植株的地上部分，在65℃的烘干箱內烘干48 h，測量植株地上生物量.

1.3.2 燕子花的生理指標測定

選擇3個晴天，在同一時間段(9：00—10：00)分別選取各處理3株植物葉片的中間部位，利用CI-340 便攜式光合作用測定儀進行凈光合作用速率的測定.

于2016年9月初，將收割的燕子花植株在室內進行生理指標的測量：選取燕子花葉片的中間部位，將其剪碎，提取測定物，用丙酮法測定葉綠素含量[38]，硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量，蒽酮比色法測定可溶性糖含量，茚三酮比色法測定脯氨酸含量，3次重復.

1.3.3 燕子花的繁殖生物學特征測定

記錄不同處理的燕子花始花日期、單花持續時間；并測量花的垂瓣長寬、旗瓣長寬、雌雄蕊高(精確到0.01 mm)，每個花部綜合特征指標測量樣本數為9.

采用聯苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性[39]：將花的柱頭取下放入凹面載玻片中，若柱頭周圍反應液成藍色并有大量氣泡產生表明柱頭具有可授性.用“+”的個數表示觀察到的柱頭可授性情況，3次重復.

采用TTC法測定花粉活力[40]：將花粉囊中的花粉取出并進行染色，顯微鏡下統計未被染色花粉數和被染色花粉數，計算花粉活力.花粉活力=被染色花粉數/(被染色花粉數+未被染色花粉數)×100%，3次重復.

花粉數量的測定：將未散粉的花粉囊中的花藥全部取出，置于1 mL的離心管中，充分擠碎，使花粉散布于離心管中，加蒸餾水定容至1 mL，充分搖勻后用移液槍取出100 μL，置于浮游生物計數框內，在顯微鏡下統計花粉數，再進行換算.最后用計數法測定花粉胚珠數(用解剖針小心挑破子房壁進行計數)，3次重復.

1.4 數據分析

采用SPSS 22.0統計分析軟件進行數據分析.先檢驗數據是否符合正態分布，對于服從正態分布的數據，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較不同處理之間數據的差異，并采用LSD法進行多重比較；對于不服從正態分布的數據，采用非參數檢驗中K-獨立樣本法比較多個處理間數據的差異，兩組間比較用兩獨立樣本非參數檢驗.顯著性檢驗的顯著度設置為P=0.05.統計數據用平均值±標準誤差表示.用SigmaPlot 12.5軟件作圖.

2 結果

2.1 不同氮素添加處理下燕子花的形態響應

在控制氮素添加量的條件下，燕子花的株高隨著氮素的添加呈現逐漸降低的趨勢(見圖1A).方差分析結果顯示，不同的氮素添加量，燕子花的葉片數并不存在顯著差異(P>0.05，見圖1B)，說明氮素的添加對于燕子花葉片數的影響并不顯著.燕子花生物量的分析結果與株高具有相同的變化趨勢，隨著氮素添加量的增加，燕子花生物量逐漸降低，對照組生物量(14.13±0.93) g顯著高于低氮組(8.11±1.40) g和高氮組(5.77±0.44) g(P<0.05).

圖1 不同氮素添加量對燕子花株高和葉片數的影響

2.2 不同氮素添加處理下燕子花的生理響應

不同氮素添加處理下，燕子花的各生理指標均出現顯著差異.隨著氮素添加量的增加，燕子花的凈光合作用速率逐漸下降，對照組凈光合速率(16.43±3.80) μmol/(m2·s)顯著高于低氮組(13.68±1.16) μmol/(m2·s)和高氮組(10.64±1.14) μmol/(m2·s)(P<0.05).燕子花葉綠素含量與凈光合作用速率的變化趨勢保持一致，也隨氮素添加量的增加逐漸降低(見圖2A).燕子花葉綠素a的含量總體高于葉綠素b的含量，且兩者與葉綠素總含量具有相同的變化趨勢.而氮素的添加對燕子花丙二醛含量(見圖2A)、可溶性糖含量以及脯氨酸含量(見圖2B)的影響表現均一致，隨著氮素添加量的增加呈現逐漸增加的趨勢.

(同列不同字母代表處理間差異顯著，下同)

2.3 不同氮素添加處理下燕子花的繁殖響應

圖3 不同氮素添加量對燕子花花部綜合特征的影響

不同氮素添加處理下，燕子花的開花物候有一定的差異，低氮組的開花日期相對于對照組推后了1 d，但開花持續時間均為3 d.開花數量低氮組(9朵)明顯低于對照組(20朵)，高濃度氮的添加抑制了燕子花的開花，高氮組開花數量為0.氮素的添加對燕子花花部綜合特征具有顯著影響，各處理組花的垂瓣長、垂瓣寬、旗瓣長、旗瓣寬以及雌雄蕊長差異顯著(P<0.05)，低氮組各指標的長度均顯著低于對照組且各處理間差異均顯著(P<0.05，見圖3).雖然對照組的花粉數、花粉活力和柱頭可授性高于低氮組，但是氮素的添加對于花粉數、胚珠數、花粉活力和柱頭可授性的影響差異不顯著(P>0.05，見表1).

表1 氮素添加量對燕子花花粉胚珠數、花粉活力和柱頭可授性的影響

注：+柱頭具有可授性；++柱頭具有較強可授性.上標字母相同表示差異不顯著(P>0.05).

3 討論

濕地的養分狀況直接決定了濕地植物的種類、數量和構成，養分的改變會直接引起濕地植被類型的改變[41].氮素是濕地生態系統中各種植物生長、發育以及繁殖所必需的營養元素之一，其含量的多少可以對濕地生態系統中的植被產生顯著影響[42].有研究表明，在氮缺乏的生態系統中，氮的輸入能刺激植物生長，提高生產力，但長期輸入氮素可使植物生物量減小[43]；在氮飽和的生態系統，氮的輸入會抑制植物的生長，甚至導致生態系統衰退[44].本實驗結果表明，隨著氮素添加量的增加，燕子花株高、生物量顯著下降，反映了金川濕地原生的土壤中氮素并不缺乏，本實驗的氮添加處理對燕子花植株的生長起到一定的抑制作用，燕子花通過改變其生長狀況來適應氮元素的輸入.由此可見，過量的氮素輸入，將改變金川濕地的初級生產力，影響濕地生態系統的平衡與穩定.這與Bauer 等[45]的研究結果一致，他們發現在森林生態系統中，高氮輸入(150 kg/(hm2·a))導致植物葉片和木材產量顯著降低.

氮素不僅是植物生長所需的一種重要養分，也是植物合成生理代謝調控物質——酶的主要組分.氮素的施加會對植物的一系列生態生理指標產生顯著影響.研究[46]表明，植物葉片中的葉綠素含量與其體內的含氮量密切相關，無論是在含氮量低的時候還是在含氮量過高的時候，植物都會降低葉片中的葉綠素含量，只有在適宜的含氮量情況下，葉綠素含量才能達到最高.張樂等[47]在研究不同濃度氮素對一串紅(Salviasplendens)營養生長影響的實驗中指出，葉綠素a和葉綠素b都是含氮化合物，而葉綠素是反應葉片功能和植株生長發育狀況的重要指標，缺氮時葉片會失綠黃化.本實驗的研究結果與此一致，氮的添加并沒有促使燕子花葉綠素含量和凈光合作用速率的提高反而出現降低趨勢，并且高氮組的燕子花植株出現葉片黃化的現象.Nakaji等[48]和Yamaguchi等[49]的研究表明，在高氮水平下植物葉綠素含量的降低可能與葉片中營養失衡有關.丙二醛(MDA)為膜脂過氧化的主要產物之一，植物在逆境條件下丙二醛含量會隨著脅迫強度的增加而升高，加速膜脂過氧化，植物細胞中丙二醛的變化大小預示著膜的受傷程度[50].本研究的結果表明，丙二醛含量隨著氮素的增加而升高，高氮處理達到最高，這可能是高濃度的氮素脅迫導致燕子花植株體的細胞膜脂出現一定的損傷，損壞了燕子花葉片細胞膜的完整性.而脯氨酸和可溶性糖是植物體內重要的滲透調節物質，植株在受到逆境脅迫時，體內滲透調節物質含量顯著增加，提高細胞原生質濃度，以增強抗逆性[51-52].本研究中可溶性糖含量和脯氨酸含量隨著氮素的增加而增加，可能是燕子花對于氮素過量的一種適應機制，表現出了一定的生理滲透調節能力的改變.

植物資源優化配置理論認為，植物各器官生物量分配的變化是應對環境因子的變化，更好地獲取空間、光照、水分、營養等有限資源，擴大植物適合度的重要機制[53-54].植物開花物候是對環境的綜合反應指標之一，作為植物物候的一個方面，開花物候涉及始花期和開花持續時間等，[55]開花物候往往也隨環境中養分的波動而有所改變，[28]特別是環境的變化往往造成花壽命的延長或縮短，而花的壽命與植物繁殖成功率密切相關[56].本文的研究結果表明，低氮處理下植株始花期和開花數量與對照組有一定的差異，花部綜合特征(垂瓣長寬、旗瓣長寬、雌雄蕊高度)具有顯著改變，反映了低氮添加使得絕對生殖資源投入有一定的減小.但是低氮組與對照組相比，其開花持續時間、花粉數、胚珠數、花粉活力和柱頭可授性均不存在顯著性差異，表明氮素過量條件下，植株繁殖投資保持相對穩定，這個趨勢與繁殖保障假說預測的結果相同[57].而高氮組(15 g/m2的氮素添加)對燕子花植株表現出一種較為嚴重的氮素脅迫，為了保證自身的存活提高對環境的適合度，燕子花選擇將資源全部分配給生長和維持存活，這也是對高氮脅迫的一種響應機制.由此可見，原生濕地土壤氮素含量對于燕子花生長較為適宜，當地管理部門應該嚴控濕地周邊農田氮肥的使用，以免氮肥通過地表水和地下水輸入濕地，對濕地植物燕子花種群造成不利影響.加強氮肥的合理使用和濕地的管理對濕地的保護和修復工作具有重要意義.

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