柴桂龍牡湯含藥血清對人乳腺癌細胞MCF－7的抑制作用及對雌激素受體α表達的影響*

蔡琳琳 ，姚明江 ，郭 全 ，吳顯文 ，朱堯武 ，許 云 △

（1.中國中醫科學院西苑醫院腫瘤科，北京 100091； 2.中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，北京 100091； 3.中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091）

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，發病率逐年上升[1]。根據分子分型制訂相應臨床決策，可使乳腺癌的治療一直處于精準醫療的前列。雌激素受體（estrogen receptor，ER）和（或）孕激素受體（progesterone receptor，PR） 陽性的乳腺癌定義為激素依賴型乳腺癌，我國此類患者占乳腺癌患者總人數的50% ～60%[2]，可通過內分泌治療抑制機體雌激素的分泌，從而降低復發和轉移風險。同時，內分泌治療可導致患者下丘腦－垂體－卵巢軸功能紊亂，誘發月經紊亂、面紅潮熱、抑郁、骨質疏松等類似圍絕經期綜合征的臨床癥狀[3]。隨著內分泌治療時間的延長，不良反應的加重，嚴重影響患者生活質量和治療依從性，導致停藥或換藥，影響患者生存期，而現代醫學尚無有效的治療手段及藥物[4]。近年來，隨著對經方辨證及用藥研究的不斷深入，其在治療腫瘤方面也起到了重要作用。課題組臨床多年使用自擬柴桂龍牡湯治療乳腺癌，發現其可緩解乳腺癌內分泌的不良反應，故本研究中選用ER陽性的人乳腺癌細胞系MCF－7細胞株進行相關試驗?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雌性 SD 大鼠 20只，體質量（200±20）g，由軍事科學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK－（軍）2012－0004。飼養于中國中醫科學院西苑醫院SPF級動物中心，飼養環境溫度22～25℃，相對濕度40% ～70%，照明/黑暗各12 h。

1.1.2 藥物

柴桂龍牡湯顆粒劑，由北京康仁堂藥業有限公司提供，藥材生產批號分別為，柴胡15022761，桂枝15019001，芍藥 15015641，半夏 15026182，黃芩 15010742，生龍骨15016901，生牡蠣 15019522，郁金 15020881，伸筋草15013951，生甘草 15013951，川牛膝 15021231，厚樸15019231。

1.1.3 細胞

MCF－7人乳腺癌細胞株，購于武漢普諾賽生命科技有限公司（產品編號為CL－0149）。

1.1.4 試劑與儀器

DMEM高糖培養基（Gibco公司，批號為8116362）；胎牛血清（Biowest公司，批號為S1435S1820）；青 －鏈霉素 PS（Solarbio 公司，批號為 20150626）；0.25% 胰蛋白酶（Solarbio公司，批號為 20150605）；MTT 試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，批號為C1310）；ERα引物、GAPDH引物（廣州易錦生物技術有限公司）；ERα兔多克隆抗體（ABclonal公司，批號為 A0296）；β －actin 兔多克隆抗體（沈陽萬類生物科技有限公司，批號為WL－01845）；辣根過氧化酶偶聯的羊抗兔IgG（CST公司，批號為 7074P2）。凝膠成像儀（Bio－Rad Chemi Doc XRS＋）；SMA－1000型超微量分光光度計（Meriton公司）；T－GRADIENT型溫度梯度PCR儀（美國Biometra公司）；Step One Plus型熒光定量 PCR儀（美國 ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠給藥劑量及含藥血清制備

按體表面積折算大鼠給藥劑量，將柴桂龍牡湯（CGLM）分為低（L）、中（M）、高（H）劑量組，劑量分別為1.2，2.4，4.8 g（顆粒）/kg（體質量）。蒸餾水配制不同濃度藥物混懸液，相當于每 10 mL含藥材顆粒 1.2，2.4，4.8 g。大鼠灌胃體積為每100 g體質量 1 mL。空白對照組給予等量蒸餾水連續灌胃7 d，末次灌胃后1 h，腹主動脈取血，分離血清，56℃，30 min熱滅活處理，0.22 μm 濾膜濾過、分裝，－20℃冰箱凍存。

1.2.2 人乳腺癌MCF－7細胞株細胞培養

人乳腺癌MCF－7細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置CO2培養箱內，恒溫37℃，5%CO2。進行細胞傳代時，先棄去培養液，隨后用PBS液洗2次，然后加入適量0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化，補加適量培養基，制備單細胞懸液，細胞計數后，配制成密度為5×104個/mL的細胞懸液，傳代培養或鋪板用于試驗。

1.2.3 人乳腺癌MCF－7細胞增殖抑制試驗(MTT法)

96孔細胞培養板中，每孔加入100 μL細胞培養懸液（每孔5×103個細胞），將細胞培養板置37℃及5%CO2培養箱中培養24 h。棄去培養基，PBS液清洗2次，每孔加入200 μL相應含藥培養基，其中空白對照組含有10%空白大鼠血清，給藥組分別含有柴桂龍牡湯低、中、高劑量10%含藥血清。試驗時用含10%空白大鼠血清DMEM培養基稀釋至所需要的濃度。加藥后再將96孔細胞培養板置37℃及5%CO2培養箱中繼續培養48 h。按說明書方法進行MTT染色，λ＝570 nm，測定光密度(OD)值，計算各給藥組抑制率。

試驗組抑制率（%）＝（空白對照組 OD值－給藥組OD值）/空白對照組 OD值×100%

1.2.4 ERα mRNA 表達檢測(qPCR 法)

取對數生長期人乳腺癌MCF－7細胞株細胞，經消化、計數，配制成密度為5×104個/mL的細胞懸液，接種于6孔細胞培養板中，24 h后更換含藥培養基，將細胞培養板置37℃及5%CO2培養箱中培養24 h，吸棄培養基Trizol裂解細胞，提取總RNA，采用PCR法反轉錄合成cDNA。取 cDNA進行實時熒光定量 PCR檢測。反應體系總體積 50 μL，ERα及 GAPDH上下游引物各 1 μL、cDNA 模板 2 μL。

ERα 引物：上游引物 5′－GCCCAGCTCCTCCTCATCCTCT－3′；下 游 引 物 5′－GCTCTCAGACTGTGGCAGGGAAAC －3′，擴增片段 281 bp。GAPDH 引物：上游引物 5′－AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG －3′，下游引物 5′－ CTGGGCTACACTGAGCACC －3′。

擴增條件：95℃預變性10 min后，9℃ 15 s，60℃1 min，40個循環，最后采用熒光定量PCR儀自帶程序進行溶解曲線分析，采用2－ΔΔCt法進行目的基因的相對定量。

1.2.5 ERα 蛋白表達檢測(Western blot法)

對數生長期細胞經胰酶消化后接種于10 cm平皿中，細胞數為1×106個/平皿，培養24 h，按對照組和試驗用藥組更換含藥培養基，繼續孵育48 h，吸出培養基，冷PBS液洗2次，用冰凍裂解液溶解細胞，將內容物移入離心管，4 ℃，10 000 r/min，離心 15 min，上清液置 －20℃保存備用。BCA法測定蛋白質濃度。

樣品進行SDS－PAGE后，電轉移至PVDF膜，用含5% 脫脂奶粉的 PBST（含 0.5%Tween－20的 PBS溶液）室溫封閉1 h，棄溶液，加入含5%脫脂奶粉的PBST稀釋的一抗（一抗 ∶ER ＝1 ∶1 000)，室溫孵育 2 h，PBST洗膜3次，加入含5%脫脂奶粉的PBST稀釋的辣根過氧化酶偶聯的二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，加入ECL顯色液，使用Bio－Rad凝膠成像分析系統掃描拍照，并測定目的條帶的密度值。將上述膜用膜再生液室溫洗脫 20 min，加入 β －actin（作為內參）抗體（1 ∶5 000稀釋）反應并檢測。計算目的蛋白條帶密度/β－actin條帶密度的相對值，以測定蛋白表達水平。

1.2.6 統計學處理

采用SPSS18.0統計學軟件分析。計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

結果見圖1至圖3。由圖1可見，對照組抑制率為（99.99 ± 9.77）%，低劑量組為（93.44 ± 14.14）% ，與對照組比較，無顯著性差異（P ＝0.159＞0.05）；中劑量組為（84.87 ±20.30）% ，與對照組比較，有顯著性差異（P ＝0.004 ＜ 0.01）；高劑量組為（80.00 ±16.93）% ，與對照組比較，有顯著性差異（P＜0.01）。由圖2可見，對照組中 ERα mRNA 表達為 1.00±0.11，低劑量組為1.09±0.71，與對照組比較，差異無統計學意義（P ＝0.36 ＞ 0.05）；中劑量組為 1.21 ± 0.11，與對照組比較，差異無統計學意義（P ＝0.38＞ 0.05）；高劑量組為1.36±0.19，與對照組比較，差異有統計學意義（P ＝0.002＜0.01）。由圖 3 可見，對照組 ERα 蛋白表達為1.00 ± 0.00，低劑量組為 1.05 ±0.64，與對照組比較，差異無統計學意義（P ＝0.60＞ 0.05）；中劑量組為1.39±0.59，與對照組比較，差異有統計學意義（P ＜0.01）；高劑量組為 1.44 ± 0.80，與對照組比較，差異有統計學意義（P ＜0.01）。

圖1 柴桂龍牡湯含藥血清對MCF－7細胞的抑制作用

圖2 qPCR法檢測各組ERα mRNA表達

圖3 Western blot方法檢測各組ERα蛋白表達

3 討論

乳腺癌的內分泌治療多從雌激素受體入手，最主要的作用點即是ER拮抗劑，以他莫昔芬為例，其抗腫瘤轉移復發作用主要是通過ERα介導，可穩定ERα，使ERα蛋白積聚，上調其表達[5－7]。ERα表達的程度是預測三苯氧胺良好應答的指標，ERα的表達缺失已被假設為他莫昔芬耐藥的主要因素。據報道，ERα的重新表達可以逆轉MCF－7細胞對他莫昔芬的耐藥[8]。

乳腺癌內分泌治療的不良反應，中醫并無相應病名，根據臨床癥狀，屬“郁證”“汗證”“百合病”“不寐”“臟躁”“絕經前后諸證”等范疇。中醫認為，乳腺癌的內分泌治療引起腎－天癸－沖任－子宮軸的平衡失調，導致肝、脾、腎三臟失和，沖任二脈也隨之衰少而引發諸癥。因本病病因復雜，癥狀繁多，隸屬中醫相關病名較多，臨床多以辨證論治為主，各醫家臨證各有不同，學術理念各有側重，綜合多篇報道，多從補益肝腎[9－11]，健脾化濕[12－13]為法立方，均獲得一定臨床療效，但對其作用機制研究甚少。

自擬柴桂龍牡湯組方為柴胡、桂枝、芍藥、清半夏、黃芩、生龍骨、生牡蠣等，全方以太陽少陽同治、調肝和胃為法，奏燮理陰陽、營衛同調為主。本中藥復方主要用藥均有抗腫瘤作用，柴胡[14]1 h和2 h的含藥血清對乳腺癌細胞MCF－7生長均有明顯的抑制作用，尤以1 h的含藥血清抑制最明顯；桂枝[15]比其主要成分肉桂酸抗腫瘤效果更強，其60%乙醇提取物能顯著抑制乳腺癌MCF－7細胞生長，表明桂枝有其他成分同時起抗腫瘤作用。Yang等[16]采用MTT法篩選出郁金有較強的逆轉人乳腺癌MCF－7細胞株的多藥耐藥性的能力。有研究發現，赤芍總苷可通過影響細胞凋亡周期的基因、阻滯細胞增殖周期等誘導腫瘤細胞凋亡，從而起到抗腫瘤作用[17]。

本研究中最初從本復方安全性出發，僅觀察對乳腺癌生長密切相關的ER等指標，并未涉及與內分泌治療聯合使用的療效，也未設計絕經后的大鼠模型，未觀察對絕經后乳腺癌細胞增殖的影響，以及與芳香化酶抑制劑（AI）的聯合作用?，F階段發現，柴桂龍牡湯有與他莫昔芬類似的抗腫瘤機制，提示其與內分泌治療藥物聯用或能更好地控制腫瘤轉移復發，尤其能為ER拮抗劑提供作用靶點，延長其使用時間，或可能逆轉內分泌耐藥。另外，本研究中也從體外細胞實驗層面為臨床使用本方提供了安全性評價依據，其對ERα的作用也為下階段進一步研究本方作用靶點，聯合內分泌用藥的協同性及進一步在臨床擴大使用提供了科學依據。

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