清熱神芎丸中黃連質量控制方法研究

王 建，李正國，劉琳琳，卞艷晶

（山東省濟寧市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟寧 272025）

清熱神芎丸收載于《衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第四冊)》[1]，由大黃、川芎、黃連、黃芩等7味藥物組方，有消腫止痛、通便瀉火功效。標準中收載了顯微鑒別和黃連的薄層鑒別方法，但尚不能對藥品的質量進行有效控制。黃連是清熱神芎丸方中主藥之一，具有清熱燥濕、抗菌消炎、利膽等藥理作用[2－4]。本研究中在考察制劑中黃芩、大黃質量控制方法的基礎上[5－6]，參考文獻[7－11]，以黃連的主要有效成分鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀為指標，優化色譜分離條件，建立測定該制劑中兩指標含量的高效液相色譜（HPLC）法，并制訂了合理的限度。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀，AgilentG1314CDAD型紫外檢測器(安捷倫公司)；XS205DU型十萬分之一電子分析天平（梅特勒－托利多儀器有限公司）；BS110S型萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SK8200LHC型超聲波清洗儀（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（批號為0752－200206，含量為86.7%），鹽酸巴馬汀對照品（批號為 110756－200110，含量為86.1%），購自中國食品藥品檢定研究院；清熱神芎丸（批號分別為 20141013，20140525，20140906，20141004， 20140316， 20140811， 20141005， 20140620，20140105， 20140314，20140808， 20140127， 20140316，20141027，20140203，20140227，山東方健制藥有限公司）；按照處方工藝，取黃芩、大黃、川芎等制備不含黃連的陰性樣品。甲醇、乙腈均為色譜純（天津四友精細化學品有限公司）；水為重蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Gold C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 － 0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（每1 000 mL中加入十二烷基硫酸鈉4 g，以磷酸調節pH至 4.0；45 ∶55）；檢測波長：345 nm；柱溫：25 ℃。理論板數按鹽酸小檗堿計算應不低于3 000。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：稱取鹽酸小檗堿對照品12.01 mg、鹽酸巴馬汀對照品11.28 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇適量溶解，定容，搖勻，作為對照品貯備液。再分別精密吸取上述鹽酸小檗堿貯備液15 mL，鹽酸巴馬汀對照品貯備液2 mL，置50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取本品 0.50 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－鹽酸（100∶1）溶液50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率 250 W，頻率 35 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇 － 鹽酸（100 ∶1）溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按處方量及制備工藝制備不含黃連的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

對照藥材溶液：稱取黃連對照藥材0.05 g，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

專屬性考察：精密吸取2.2項下4種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣分析。結果供試品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對照品溶液色譜相同保留時間處有相應吸收峰，陰性對照品溶液色譜則無此吸收峰，表明處方中其他藥味對測定無干擾(見圖1)。

線性關系考察：精密吸取混合對照品溶液2，4，6，8，10，12 μL，進樣測定。以進樣量(X，μg）為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得鹽酸小檗堿回歸方程為 Y＝1 328.727 X－2.505(r＝0.999 979，n＝6），鹽酸巴馬汀為 Y＝1 404.406 X－0.625(r＝0.999 984，n＝6）。結果表明，鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀進樣量分別在 0.125 0 ～0.749 7 μg 和 0.015 5 ～ 0.093 2 μg 范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取混合對照品溶液，按上述色譜條件連續進樣5次。結果鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀平均峰面積分別為 415.968±3.324 和 53.836±0.420，RSD 分別為0.80%和0.78%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批樣品5份，依法制備供試品溶液，進行測定。結果鹽酸小檗堿的平均含量為（0.5768±0.003 55）mg/g，RSD 為 0.62%(n ＝5)；鹽酸巴馬汀平均 含 量 為 （2.225 0 ± 0.014 5）mg/g， RSD 為 0.65%(n＝5)。表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，每隔1 h測定1次，測定10次。結果鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿平均峰面積分別為 83.635 和 332.310，RSD 分別為 0.55% 和0.45%(n＝10)，表明供試品溶液在10 h內穩定。

加樣回收試驗：精密吸取混合對照品溶液2 mL（含鹽酸巴馬汀 0.150 2 mg、鹽酸小檗堿 0.541 8 mg）6 份，置具塞三角瓶中，揮干甲醇。取已知含量的樣品6份，分別置上述具塞三角瓶中，依法制備供試品溶液，測定鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量，計算回收率。結果見表1。

圖1 專屬性考察高效液相色譜圖

2.4 樣品含量測定

取16批樣品，每批2份，均按2.2項下方法操作，制備供試品溶液。按擬訂色譜條件進行測定。結果見表 2、圖 2和圖 3。

2.5 耐用性試驗

流動相pH考察：調節流動相的pH分別為 4.0，4.2，3.8，按供試品測定方法測定，結果見表 3。結果顯示，流動相 pH適量變化，不影響2種成分的分離度和測定結果。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）

表2 樣品含量測定結果（n＝2）

圖2 16批次樣品中2種成分含量分布圖

圖3 16批次樣品中2種成分比值分布圖

表3 流動相pH考察

流動相比例考察：以乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相，分別組成 45∶55，50∶50和52∶48的流動相進行測定，結果見表4。可見，流動相中乙腈用量減少，2種成分保留時間延長，分離度增加；乙腈用量增加則保留時間縮短，流動相組成比例的適量變化不影響測定結果。

柱溫考察：分別設置柱溫為20，25，30℃，對樣品分離效果進行考察，結果見表5。可見，20℃時影響鹽酸小檗堿色譜峰峰面積的積分值，色譜分離效果降低，保留時間延長，故選柱溫為25℃。

表4 流動相比例考察

檢測波長考察：分別以343，345，347 nm為檢測波長進行測定，結果見表6。可見，波長的適度變化不影響含量測定。

色譜柱考察：在色譜分析中，以色譜柱的類型和規格對分離效果影響較大。本研究中分別選用Agilent EclipseXDBC18柱（250mm×4.6mm，5μm）[色譜柱（Ⅰ）]、Thermo Hypersil Gold C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）[色譜柱（Ⅱ）]和 WatersSunFireTMC18柱（250mm ×4.6mm，5 μm）[色譜柱（Ⅲ）]進行考察，結果 2種成分均可有效分離，但色譜柱（Ⅲ）色譜峰保留時間長。結果見表7。

表5 柱溫考察結果

表6 檢測波長考察結果

表7 色譜柱考察結果

3 討論

3.1 測定條件選擇

檢測波長選擇：經二極管陣列檢測器(DAD)在線檢測，鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀在345 nm波長處均有較強吸收，故以345 nm為檢測波長。

流動相選擇：選用 Thermo Hypersil Gold C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）為色譜柱，參考文獻[2]，以乙腈 －0.1%磷酸溶液、乙腈 －0.05 mol/L磷酸氫二鉀溶液和乙腈－0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相進行檢測，結果本研究中所用流動相色譜法分離效果最好，黃連主要成分得到有效分離，可用于多成分測定。

提取方法選擇：以甲醇－鹽酸（100∶1）為溶劑，分別采用超聲提取樣品和超聲提取后過中性氧化鋁柱2種方法制備供試品溶液。結果測得鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀含量相同，均可用于該產品的含量測定，但應對所使用中性氧化鋁進行考察。第1種樣品處理方法較簡便，故選擇本研究中選定的方法。但樣品溶液經中性氧化鋁柱處理后，樣品中黃連的5個色譜峰分離較好，可除去其他雜質色譜峰，可用于黃連的液相色譜鑒別。

提取時間考察：取樣品4份，每份約 0.5 g，精密稱定，分別置具塞三角瓶中，分別以不同的超聲提取時間制備供試品溶液，按上述方法測定，計算樣品中鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿的含量，結果提取30，45，60 min的效果基本一致，故選用30 min。

3.2 測定結果分析

16批樣品的HPLC色譜圖有5個主要色譜峰，與黃連對照藥材的色譜峰一致，鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀含量呈正相關，15批樣品中2種成分含量的比值基本一致，比值的平均值為 3.88，RSD為 2.4%，其中 1批次樣品（批號 20140203）2成分比值較低(3.64)。可知樣品所用黃連品種基本一致。樣品中2種成分含量的總和存在較大差異，7批次樣品總含量在 1.68～3.055 mg/g之間；9 批次樣品總含量在 1.19～1.45 mg/g 之間。2010年版《中國藥典(一部)》規定黃連中以鹽酸小檗堿計含小檗堿（C20H17NO4）不得少于 5.5% ，巴馬汀（C21H21NO4）不得少于 1.5%。按最低含量計算，制劑中小檗堿與巴馬汀的含量分別不得低于 2.00 mg/g和0.55 mg/g。本研究中顯示，所測樣品中有3批次符合要求，其他批次2種成分均偏低，需進一步對生產工藝和原料進行研究，確定合理限度。因此，亟待建立該產品中黃連的質量控制方法，以保證產品質量。

[1]WS3－B－0840－91.衛生部藥品標準·中藥成方制劑(第四冊)[S].

[2]雷志英，黃連及黃連素的藥用安全性[J].中國藥業，2010，19（9）：84－86.

[3]謝 梅，徐春紅，胡正波，等.管碟法比較鹽酸小檗堿和黃連藥材對金色葡萄球菌的抑菌效力[J].中國藥業，2012，21（19）：9－11.

[4]徐國良，馬曉雪，張啟云.代謝組學評價黃連對大鼠藥理作用的初步研究 [J].中國中藥雜志，2009，34（14）：1845 －1847.

[5]劉琳琳，卞艷晶，王 紅.RP－HPLC法測定清熱神芎丸中黃芩苷的含量[J].齊魯藥事，2010，29（10）：590 － 591.

[6]李正國，于立佐.清熱神芎丸中大黃質量控制方法的研究[J].齊魯藥事，2007，26（9）：531 － 533.

[7]李志峰，王 琦，馮育林，等.黃連的化學成分研究[J].中草藥，2012，43（7）：1273 － 1275.

[8]彭 福，瞿顯友，鐘國躍，等.HPLC法測定黃連不同部位中6 個生物堿[J].中草藥，2012，43（3）：509 － 512.

[9]李茂森.復方黃連素片中鹽酸小檗堿含量測定方法改進[J].中國藥業，2013，22（14）：68 －69.

[10]劉暉暉，張 輝，莫結麗，等.一測多評法測定黃連配方顆粒中 4 個成分的含量 [J].中國藥學雜志，2012，21（10）：39－40.

[11]耿志鵬，鄭海杰，張 藝，等.RP－HPLC測定不同產地黃連中 6 種生物堿的含量 [J].中國中藥雜志，2010，35（19）：2576－2580.