胎膜早破時MONO、PMN含量與新生兒感染的關系研究

楊智輝 ， 劉媛媛，劉 輝

1.北大醫療淄博醫院兒科(淄博 255069) ，2.山東省濟寧市第一人民醫院呼吸科(濟寧 272011)

胎膜早破指臨產前胎膜自然破裂，為臨產前常見病理現象，與感染、胎膜發育不良、宮腔內壓力異常、子宮頸功能不全、機械性刺激、創傷等因素密切相關[1]。流行病學調查發現若胎膜早破>24 h，可誘發新生兒敗血癥、多臟器功能損害、感染等，嚴重情況下危及母兒生命，而胎膜早破母體新生兒出生后感染率普遍高于足月正常分娩新生兒，其敗血癥、膿毒癥等感染率高達1%～10%[2]，故早期發現感染并予以及時救治，對改善患兒預后具有重要意義。目前，常規感染預測指標C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)等對新生兒細菌感染具有較好的預測價值，但其靈敏度、特異度有所欠缺[3]。近年來，有報道稱[4]炎癥標志物可溶性髓樣細胞觸發受體-1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)、中性粒細胞CD64(Leukocyte surface antigens CD64，CD64)對新生兒細菌感染具有較好的診斷意義，但關于臍血單核細胞計數(Monocyte count，MONO)、中性粒細胞(Polymorphonuclear neutrophil，PMN)表面TREM-1、CD64的表達水平預測胎膜早破母體新生兒感染鮮有報道。本文主要探究胎膜早破時MONO、PMN含量對新生兒感染的預測價值，報道如下。

資料與方法

1 一般資料 納入2014年8月至2017年8月于我院收治的110例足月胎膜早破新生兒為觀察組，其中男58例，女52例，胎齡37～40(38.40±0.75)周，新生兒體重3.5～5.2(3.40±0.25)kg；產婦年齡21～34(27.42±1.38)歲；新生兒評分(Apgar評分)：1 min時為(9.75±0.52)分，5 min時為(9.90±0.35)分；并選取同期正常新生兒110例為對照組，其中男60例，女50例，胎齡38～40(38.68±0.45)周，新生兒體重3.7～5.4(3.52±0.27)kg；產婦年齡23～33(27.53±1.35)歲；Apgar評分：1 min時為(9.72±0.54)分，5 min時為(9.94±0.28)分。本研究獲我院醫學倫理委員會批準，兩組新生兒性別、胎齡、體重等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：①符合《臨床婦產科學》[5]中相關診斷標準，伴陰道流液，經陰道窺器檢查發現羊水自宮頸口流出；微鏡下陰道液干燥涂片試驗可見羊齒狀結晶；石蕊試紙測測試pH>7；②單胎頭位妊娠，胎齡≥37周；③新生兒家屬對本研究知情且簽署同意書。排除標準： ①新生兒合并先天性免疫缺陷、先天性發育畸形、代謝障礙等疾病；②巨大兒或極低體質量新生兒；③產婦伴臨床細菌感染、先天性心臟病或HPV感染陽性者。

2 研究方法

2．1 儀器與試劑：采用北京時代北利離心機DT5-1型(北京時代北利有限公司)，FACScalibur型流式細胞儀、溶血素均購自美國Becton Dickinson公司，酶標儀為美國Bio-Rad公司產品，37℃恒溫箱、微量加樣器、真空采血管(EDTA-K2抗凝)均源自德國Hereaus公司，TREM-1-PE單克隆抗體、CD45-Krome Orange單克隆抗體、CD64 PerCp-CY 5.5單克隆抗體、IgG1 Krome Orange、IgG1-PE、IgG1 PerCp-CY 5.5均購自美國Becton-Dickinson公司。

2.2 臍血標本采集：待新生兒娩出后采集EDTA抗凝臍靜脈血3 ml，即刻送至流式細胞實驗室待測。準備測定管與同型對照管，每管保持100 μl，將TREM-1-PE、CD45-Krome Orange、CD64 Per Cp-CY 5.5(均為10 μl)分別置入測定管中，并將IgG1-PE、IgG1 Krome Orange、IgG1 PerCp-CY 5.5(均為10 μl)分別置入同型對照管中。送至室溫孵育，維持20 min后添加溶血素，待振蕩混勻處理后送至室溫，待孵育10 min后加入無鈣離子PBS緩沖液3 ml，按照1500 r/min速度離心5 min。棄上清后將細胞懸浮于0.5 ml無鈣離子PBS緩沖液中，振蕩混勻于30 min內予以上機檢測。注意每個樣本獲取≥10000個目標細胞，應用Kaluza軟件予以數據分析。

2.3 胎盤標本采集：待胎盤盤娩出后留取胎膜組織、大小胎盤(約1cm×1cm)，立即將標本置入4%多聚甲醛固定。待固定處理后予以脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片處理，注意切片厚度維持5 μm。由3名經過系統培訓的檢驗醫師行雙盲法閱片，判斷是否為絨毛膜羊膜炎。絨毛膜羊膜炎診斷標準：參考《臨床婦產科學》[5]，當胎膜或胎盤任何一處中性粒細胞浸潤每高倍視野≥11個即可確診。

2.4 外周血炎癥指標檢測方法 ： 嚴格參考《全國臨床檢驗操作規程》，由3名經過專業培訓的檢驗醫師應用酶聯免疫法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測血清CRP、IL-6、降鈣素原(Procalcitonin，PCT)、血小板計數(Peripheric platelet count，PLT)，并采用全自動血細胞分析儀檢測外周血白細胞計數(White blood cell，WBC)。

2.5 TREM-1、CD64表達水平檢測方法：由3名通過專業培訓的檢驗醫師嚴格參照《全國臨床檢驗操作規程》，采用雙抗體夾心法與流式細胞術檢測TREM-1、CD64水平，比較MONO表面TREM-1 MFI比值、MONO表面CD64 MFI比值、PMN表面TREM-1 MFI比值、PMN表面CD64 MFI比值。

3 觀察指標 觀察兩組外周血炎癥指標變化，包括CRP、IL-6、WBC、PLT，并分析胎盤病理診斷結果、新生兒感染情況及臍血TREM-1、CD64表達水平。新生兒感染診斷標準：參考《實用新生兒學(第4版)》[6]，DNA或病原菌抗原檢測呈陽性；非特異性檢查≥2條：①于新生兒出生2 h后采血，WBC減少<5×109/L，或增多(其中>3 d者WBC>20×109/L，<3d者WBC>25×109/L)；②桿狀核細胞/中性粒細胞比值≥0.16；③炎癥發生6～8 h后CRP明顯升高；④微量血沉≥15 mrn/lh；⑤PLT≤100×109/L。存在感染臨床表現且具備以上任意一條即可確診。

結 果

1 兩組外周血炎癥指標比較 觀察組CRP、WBC、PLT、IL-6、PCT水平較對照組顯著升高(t=12.595、3.043、4.446、106.043、13.265，P=0.000、0.003、0.000、0.000、0.000)，見表1。

表1 兩組外周血炎癥指標比較

2 兩組胎盤病理診斷結果與新生兒感染率比較 經胎盤組織病理診斷發現，觀察組絨毛膜羊膜炎發生率為34.55%，對照組為11.82%，差異有統計學意義(χ2=14.702，P=0.000)；于產后1周(圍產兒期)內，觀察組新生兒感染率為22.73%(25/110)，對照組為6.36%(7/110)，差異有統計學意義(χ2=11.848，P=0.001)，見表2。

表2 兩組胎盤病理診斷結果與新生兒感染率比較[例(%)]

3 兩組臍血TREM-1、CD64表達水平比較 觀察組臍血MONO、PMN表面TREM-1、CD64 MFI比值顯著高于對照組(t=14.888、8.345、11.919、35.767，P=0.000、0.000、0.000、0.000)，見表3。

表3 兩組臍血TREM-1、CD64表達水平比較%)

4 感染組與未感染組TREM-1、CD64表達水平比較 感染組臍血MONO、PMN表面TREM-1、CD64 MFI比值顯著高于對照組(t=2.064、2.452、2.007、2.148，P=0.041、0.016、0.047、0.034)，見表4。

表4 感染組、未感染組臍血TREM-1、CD64表達比較%)

討 論

有報道稱新生兒，尤其是早產兒，其免疫系統發育尚未完全成熟，免疫功能并不完善，感染風險較高，嚴重情況下會出現膿毒血癥，具有較高的病死率[7]。伴隨著臨床診療技術的不斷發展，譬如各種內鏡檢查、穿刺、導管插管留置、透析療法等在臨床得到了廣泛應用，但新生兒感染發病率未明顯下降。目前，國內外檢測技術較為成熟，外周血血常規、CRP、IL-6、PCT等炎癥檢測指標在新生兒感染性疾病早期診斷中得到了廣泛推廣。

本文研究結果顯示，觀察組CRP、WBC、PLT、IL-6、PCT 水平較對照組明顯升高，絨毛膜羊膜炎、產后1周(圍產兒期)內新生兒感染率明顯高于對照組，證實早期新生兒感染時上述外周血炎癥指標異常升高，易誘發病原菌經臍帶血侵入圍生兒機體，致使新生兒感染。CRP為感染預測及監控的急性時相反應蛋白，正常狀況下其水平較低，一旦機體遭受傷害性刺激或微生物侵入時，于短時間內該因子大量合成并釋放入血，待感染消退后逐漸恢復正常水平[8]。有報道稱IL-6與多種病原微生物、細菌、病毒等誘發的機體感染密切相關，一旦遭受病原微生物侵入即可激活轉化為蛋白，刺激IL-6基因啟動因子，促使其表達水平異常激活，誘發促炎癥反應[9]。黃麗嬌等[10]報道胎膜早破患者逆行宮內感染能誘導血CRP、IL-6水平明顯上升，一定程度上會促使炎癥反應加重。此外，對于宮內感染的胎膜早破患者來講，胎兒遭受病原微生物侵入的風險較高，而胎兒娩出后新生兒感染風險隨之升高，故胎膜早破外周血CRP、IL-6對新生兒感染存在一定預測價值。WBC計數為臨床感染鑒別常用指標，但部分新生兒感染WBC計數無明顯變化，單一依據WBC計數診斷是否出現感染，其結果準確性欠佳。PCT屬于降鈣素前肽物質，為一種無激素活性糖蛋白，由116個氨基酸組成，正常生理狀況下由甲狀腺C細胞形成，血漿內含量較低，細菌感染時會由甲狀腺以外組織大量產生，PCT水平異常升高，這與本文結論吻合[11]。

此外，本研究發現觀察組臍血MONO、PMN表面TREM-1、CD64 MFI比值明顯高于對照組，且感染組上述指標較對照組明顯升高，證實胎膜早破及新生兒感染與臍血TREM-1、CD64表達水平密切相關，而胎膜早破>24 h，臍血PMN、MONO表面TREM-1、CD64表達可能被激活，CD64、TREM-1參與了胎膜早破與新生兒感染的炎癥反應過程。TREM-1屬于免疫球蛋白超家族中重要成員，可在成熟單核細胞、CD14+單核/巨噬細胞、中性粒細胞等髓系細胞中表達，為炎癥反應上游因子。作為先天免疫效應細胞模式識別受體，當機體遭受病原微生物侵入后基于TREM-1刺激下可觸發并放大級聯反應與宿主反應，利用TREM-1表達水平能對機體感染嚴重程度進行判斷，具有放大、激發炎癥反應，并可促進抗炎因子下調[12]。有研究證實，伴隨著細胞因子的參與與炎癥反應的逐漸加劇，會促使機體出現急性失控性炎癥反應，引起早期新生兒感染，這與本研究結果相符，證實臍血TREM-1對胎膜早破是否并發早期新生兒感染進行預測[13]。CD64屬于免疫球蛋白IgG Fc段受體1，于MONO、樹突狀細胞、巨噬細胞表面分布，對IgG單體的親和力較高，能對免疫球蛋白進行識別，并依次作用于介導細胞免疫與體液免疫過程，調控二者平衡。正常狀況下，CD64于PMN表面呈低表達，機體感染下PMN表面CD64 表達呈明顯升高趨勢。近年來，有研究發現新生兒感染與母血、胎盤組織、羊水中CD64表達升高有關，在胎膜早破孕產婦中，尤其是針對宮內感染者，中性粒細胞表面CD64被異常激活，呈高度表達，故其對孕產婦早期感染與新生兒感染中存在一定預測價值[14]。有報道稱胎膜早破孕產婦基于病原微生物侵襲下容易出現宮內感染，母血TREM-1、CD64水平呈過度表達，而病原微生物經臍血直接作用于胎兒，進一步增加了圍生兒感染風險，證實母血TREM-1、CD64表達水平與胎膜早破孕產婦新生兒存在明顯關聯，這與本文研究結論吻合。

本文雖證實胎膜早破及新生兒感染與臍血PMN、MONO表面TREM-1、CD64表達密切相關，但本文仍存在一些不足之處，如選取樣本量有限，可能存在抽樣誤差；于入院后即刻檢測母血CRP、PLT、IL-6、CD64、TERM-1等水平，關于其水平變化趨勢是否對新生兒感染產生影響仍需深入研究；胎膜早破發生孕周是否對結果產生影響，尚需大樣本數據進一步驗證

綜上所述，臍血PMN、MONO表面TREM-1、CD64表達對胎膜早破及新生兒感染具有預測價值，值得臨床積極推廣。

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