外周血結核感染T細胞斑點試驗和胸水腺苷脫氨酶活性檢測在結核性胸腔積液診斷中的應用評價*

韓利梅，李 新，穆清爽，努爾阿米娜·鐵力瓦爾迪，張 慧，古力鮮·馬合木提

新疆醫科大學第二附屬醫院呼吸科 (烏魯木齊 830063)

結核病是全球性質的重大傳染性疾病之一 。世界衛生組織2004年的報告顯示，結核病的確診率僅約37%，即使在發達國家也僅有50%[1]。尤其是對于結核性胸膜炎(Tuberculous pleurisy,TBP)等肺外結核，診斷與鑒別診斷比較困難，極易造成誤診、漏診和延遲診斷，TBP診斷主要依靠檢驗與檢查手段，然而胸部檢查敏感性較差。雖然經皮胸膜活檢具有較高的敏感度，但其盲目性較大，加之取材有限，極易誘發氣胸等并發癥。外科胸腔鏡花費大、無菌操作要求高，且視野有限，極易發生漏診[2，3]。因此迫切需要尋找一種快速、準確、可靠的診斷方法。在胸腔積液的生化檢測中，ADA活性檢測被認為是診斷結核性胸膜炎較為準確的指標[4]。目前，外周血T-SPOT.TB開始作為新的診斷結核感染方法廣泛應用,該種檢測方法具有較高敏感度和特異度[5]。本研究旨在胸腔積液患者進行以上兩種方法檢測，進一步明確其對于結核性胸腔積液的診斷價值。

資料與方法

1 一般資料 選取2015年1月至2016年11月在我院住院的122例胸腔積液患者，將納入患者根據癥狀、結核分歧桿菌培養、痰涂片抗酸染色、病理學檢驗以及臨床抗結核反應，將所有納入患者分為結核組(n=52例)和非結核組(n=72例)，兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2 研究方法

2.1 胸腔積液ADA檢測：胸腔穿刺采集胸腔積液，中量和少量積液者在B超定位下進行穿刺取積液，取5 ml胸腔積液于無菌試管中，離心10 min后取上清液進行ADA水平測定。試劑盒由美國貝克曼公司生產，并采用同一公司的生化分析儀進行結果分析， ADA>45 U/L作為診斷臨界值。

2.2 T-SPOT.TB檢測：采集患者外周血5 ml置于肝素抗凝管中，分離單個核細胞，經過兩次洗滌與重懸后加入相應的培養液制成細胞稀釋液，留待備用。試劑盒來自英國OXFD公司，試驗步驟按照試劑盒說明書進行。

根據A孔和B孔來判斷反應結果：①陰性對照孔如果出現的斑點數為0～5，那么陽性結果設定：要求A孔或B孔出現的斑點數減去陰性對照孔出現的斑點數的數值應≥6；②如果陰性對照孔發現的斑點數≥6，那么陽性結果設定：要求出現在A孔或B孔的斑點數要超過或等于陰性對照孔出現斑點數的2倍。

2.3 其他檢測：所有納入患者行痰分歧桿菌培養、痰涂片抗酸染色、組織病理學檢查。

結 果

1 外周血T-SPOT.TB與ADA檢測結果比較 結核組的外周血T-SPOT.TB與ADA陽性率均明顯高于非結核組(P<0.01)，結核組外周血斑點平均數與ADA活性也高于非結核組，差異具有統計學意義(P<0.01)，見表1，表2。

2 ROC曲線分析 ROC曲線可以用來分析各項檢測指標對于結核性胸腔積液的診斷效果，由圖1及表3分析得出，A、B孔斑點平均數ROC曲線下的面積(AUC)>0.9，ADA的AUC為0.846，可見A、B孔斑點平均數的診斷價值較高。A、B孔斑點平均數的敏感性為98.00%，特異性73.60%，ADA的敏感性91.80%，特異性82.60%。

表1 兩組患者T-SPOT.TB與ADA陽性率比較[例(%)]

表2 兩組患者外周血斑點平均數與ADA活性比較

圖1 外周血A、B孔斑點平均數及ADA的ROC曲線

檢測指標AUC95%C.I.P截點敏感性(%)特異性(%)A孔斑點平均數0.9210.859^0.971<0.01098.0073.60B孔斑點平均數0.9190.862^0.967<0.01098.0073.60ADA(U/L)0.8460.781^0.918<0.012891.8082.60

3 外周血T-SPOT.TB與ADA互補關系 結核組中4例患者外周血T-SPOT.TB陰性，但有3例ADA檢測結果為陽性。非結核組中有12例外周血T-SPOT.TB為陽性，但有10例ADA檢測為陰性。

討 論

TBP屬于最常見的肺外結核病，主要與結核分枝桿菌及其他代謝產物浸及高敏狀態的胸膜腔所致[4]。TBP主要表現為胸腔積液所致的局部癥狀(胸痛、呼吸困難、干咳等)與全身中毒癥狀(出汗、畏寒、發熱、盜汗、食欲不振等)，積液少時僅有氣促、胸悶等癥狀，大量積液形成后可壓迫肺、縱隔與心，加重呼吸困難，且隨著積液形成與聚集的增加，呼吸困難癥狀越為明顯，甚至可導致端坐呼吸與發紺[5]。目前，臨床主要采用胸膜活組織檢查、結核菌素皮膚試驗、胸腔積液細菌學檢查(結核分枝肝菌培養與抗酸染色涂片)與胸腔積液生物化學檢查等。其中胸膜活組織檢查具有較多方式，但其各有缺陷；結核菌素皮膚試驗所使用的結核菌素純蛋白衍生物為200多類蛋白的混合物，含有卡介苗與非結核分枝桿菌的共同抗原成分，所以接種卡介苗的群體經該技術檢查后可呈現較高的假陽性率[6]；胸腔積液細菌學檢查則是診斷結核性胸膜炎的金標準，然而耗時長，陽性率過低[7]。胸腔積液生物學技術是診斷結核性胸膜炎主要方法，尤其是胸水ADA活性檢查現已成為許多國家診斷結核性胸膜炎的常規技術。有研究對ADA在結核性胸膜炎中的應用效果進行了薈萃分析，認為對胸腔積液進行ADA檢驗具有顯著的應用價值[8]。也有學者認為，ADA特異性與敏感度偏低，其中特異度偏低多見于類風濕性疾病與肺炎旁積液患者，而敏感性降低可能與機體免疫功能減退及早期炎癥有關[9]。

近年來，隨著臨床檢驗技術的不斷發展與完善，在特異T細胞檢測中，ELISPOT已成為最敏感的方法之一，該技術能夠將抗原特異細胞從數量眾多的外周血單個核細胞中檢測出來。Lalvani根據ELISPOT檢測的相關原理，利用ESAT-6和CFP-10，從外周血結核中檢測出了特異性的T細胞[10]，因此T-SPOT.TB開始作為診斷結核感染的新方法而應用到臨床。部分研究發現，T-SPOT.TB具有較佳的特異性與敏感性，且不受卡介菌的影響。有學者研究認為，T-SPOT.TB對于結核病具有顯著的診斷價值，尤其是對于結核性胸膜炎，陽性率可高達91.67%[11]。此外，T-SPOT.TB的高敏感性已被多項臨床試驗證實。王永生等[12]對結核性胸膜炎的患者進行了外周血T-SPOT.TB檢測，發現其敏感性達到了95.8%。學者郭曉酮等[13]對比了胸腔積液ADA與外周血T-SPOT.TB對TBP的 診斷效果，結果顯示胸腔積液ADA與外周血T-SPOT.TB診斷TBP均具有較佳的特異度(94.4%VS86.1%)，但T-SPOT.TB較ADA的敏感度更高(88.9%VS46%)，且兩者聯合檢測的敏感度高達92.1%，認為臨床工作中將T-SPOT.TB與ADA聯合應用可以有效提高TBP的診斷率。本研究發現結核組的外周血T-SPOT.TB與ADA陽性率均明顯高于非結核組，結核組外周血斑點平均數與ADA活性也顯著高于非結核組。A、B孔斑點平均數ROC曲線下的面積(AUC)>0.9，敏感性達到了98.00%，與既往多項研究基本一致[14]。T-spot.TB是檢測早期分泌抗原(ESAT-6)和培養過濾蛋白(CFP-10)這2個抗原刺激時淋巴細胞分泌的INF-γ，計數熒光標記釋放TNF-γ的T淋巴細胞的個數來了解機體是否處于結核感染狀態。與劉菲等[15]發現ESAT-6與CFP-10的融合蛋白敏感性要比ESAT-6單用時明顯增高，本研究中單用ESAT-6或單用CFP-10均具有較高敏感性(98.00%)，考慮與樣本量大小、研究對象差異及有可能的誤差相關，需要進一步的大樣本詳盡數據支持。同時，相較于結核菌素試驗，T-SPOT.TB不受卡介苗的影響，且多數非結核分枝桿菌具有較低的交叉免疫反應，檢測周期短，操作簡便，還適用于支氣管肺泡灌洗液、腹腔積液、痰液、腦脊液等標本，應用范圍較廣。

研究中顯示，A、B孔斑點平均數的特異性為73.60%，ADA的特異性82.60%，兩者的診斷特異性均不是特別理想，筆者對兩者的互補關系也進行了研究，結果顯示結核組中4例患者的外周血T-SPOT.TB陰性，但有3例的ADA檢測結果為陽性。非結核組中有12例外周血T-SPOT.TB為陽性，但有10例ADA檢測為陰性。可以看出，兩者的聯合檢測對診斷結核有更高的價值。非結核組中T-SPOT.TB假陽性率較高，筆者考慮可能與陳舊性結核及潛伏期結核相關，當然另一可能原因與目前的檢測手段無法對肺外微小結核灶進行有效的發現有關[8]。

綜上所述，外周血結核感染T細胞斑點試驗是一種快速 、簡單、準確、無創的檢測手段，對于診斷結核性胸腔積液價值較高，但特異性偏低，與ADA聯用時診斷會更為準確。

[1] 杜方雄,何 敏,廉國利,等.酶聯免疫斑點試驗對肺外結核病的輔助診斷價值[J].陜西醫學雜志,2015,44(8):1009-1010.

[2] 雷芳玉,劉定安,王 博,等.肺結核辨病論治與辨證施治[J].陜西中醫,2006,27(4):454-455.

[3] 秦 慶,胡 瑛,呂永強.痰涂片抗酸染色、結核抗體試驗、熒光PCR、T-SPOT.TB在肺結核診斷中的臨床意義[J].中國醫藥科學,2017,7(21):130-133.

[4] 陳焯平,林麗珠.林麗珠教授運用桂苓甘味湯治療肺癌惡性胸腔積液經驗[J].陜西中醫,2016,37(3):342-343.

[5] 馮曉朦,王晶瑩,時景偉，等.血清ADA水平和T-spot.TB聯合檢測在肺結核診斷中的應用[J].吉林大學學報：醫學版,2016,0(2):306-310.

[6] 樂 軍，梁 莉，李蘇輝，等 . 酶聯免疫斑點試驗快速診斷結核分枝桿菌感染的臨床應用價值 [J]. 中華檢驗醫學雜志，2006，29(11)：1005-1008.

[7] 馬 珂,馬 騰,劉增運,等.T-SPOT. TB和結核菌素試驗在骨關節結核診斷中的敏感性和特異性分析[J].國際檢驗醫學雜志,2017,38(20):2840-2841+2844.

[8] Tay TR, Tee A. Factors affecting pleural fluid adenosine deaminase level and the implication on the diagnosis of tuberculous pleural effusion: a retrospective cohort study[J]. BMC infect Dis, 2013,13(1):546.

[9] 韓利梅,穆清爽,努爾阿米娜·鐵力瓦爾迪,等.結核分枝桿菌T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)技術在結核性胸膜炎診斷中的診斷價值[J].湖南師范大學學報：醫學版,2018,15(2):32-35.

[10] Pai M,Zwerling A,Menzies D. Systematic review:T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update[J]. Ann Intern Med,2008,149(3):177-184.

[11] 吳小慧,汪 峰,孫自鏞.T-SPOT.TB試驗中TBAg/PHA比值在結核性腦膜炎早期診斷中的應用[J].神經損傷與功能重建,2018,13(1):20-22+25.

[12] 王永生，徐小雅，楊 華，等. T-SPOT.TB試劑盒在結核性胸膜炎臨床診斷中的應用價值[J]. 四川醫學，2011，32(12):1854-1856.

[13] 郭曉桐,范玉春,賈 偉,等.結核桿菌感染T細胞斑點試驗對結核性胸膜炎的診斷價值[J].寧夏醫科大學學報,2017,39(5):509-514.

[14] 石學萍,王 晶,王 鑫,等.結核分枝桿菌感染T細胞斑點試驗在疑診肺結核患者中的臨床應用[J].解放軍醫學雜志,2017,42(11):996-1000.

[15] 劉 菲，張宗德，高孟秋，等. 不同抗原的酶聯免疫斑點檢測技術對結核病的輔助診斷價值比較[J]. 中華結核和呼吸雜志，2009，32(11):838-841.