丙型肝炎患者血清病毒宏基因組學研究*

李 旺，倪 萍，周成林

(江蘇省泰州市人民醫院檢驗科 225300)

病毒宏基因組學方法在病毒學研究方面具有獨特優勢，它既能夠檢測標本中的已知病毒，又能夠檢測標本中的未知病毒。目前，病毒宏基因組學方法已得到廣泛應用。KRABERGER等[1]應用病毒宏基因組學方法從污水處理池發現了許多新的單鏈環形DNA病毒。楊凡力等[2]同樣應用病毒宏基因組學方法在蝙蝠體內發現腺病毒、圓環病毒、細小病毒、博卡病毒等新病毒。ZHANG等[3]應用病毒宏基因組學方法在牛肉中檢測與感染靈長類多瘤病毒親緣關系最近的牛多瘤病毒(BPyV2-SF)。用病毒宏基因組學方法對腹瀉兒童及健康兒童的糞便標本進行檢測，發現腹瀉標本中主要存在指環病毒、杯狀病毒和Salivirus,而正常兒童糞便標本中最多的病毒依次為指環病毒、Tymovirus和人雙埃可病毒。此外，兩組標本中病毒序列數量相差甚遠，并且首次在中國兒童腹瀉糞便標本中發現了第4基因群型(諾如病毒)。應用病毒宏基因組學方法對兒童呼吸道標本和腦脊液樣本進行研究顯示，不同標本及不同健康狀態下病毒群體的組成存在一定差異。丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一種傳染性疾病，全球有1.3～2.1億人感染HCV并轉變為慢性感染者，對人類的健康造成嚴重威脅[4]。因此，進行HCV致病機制及相關性研究對于預防和治愈丙型肝炎有重要意義。本研究應用病毒宏基因組學方法對HCV-RNA陽性血清標本進行研究，以了解HCV-RNA陽性血清樣本中病毒群落的組成，并與健康人群血清病毒群落的組成進行比較，發現二者之間病毒組成的差異性，為探索和研究與丙型肝炎相關的其他病毒提供前期研究基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1標本采集 選取2015年4月至2016年7月泰州市人民醫院收集的30份HCV-RNA陽性患者血清標本，男、女性各15份；另選取10份健康人群血清標本，男、女性各5份。

1.2標本分組設計 考慮到構建病毒文庫成本較高，本研究根據性別及病毒載量將每10份標本作為一組，各組內每份標本取150 μL混合制成混合液，構成4個標本文庫。詳細信息見表1。

表1 標本組合信息

1.3核酸酶消化 在4支1.5 mL的無RNA酶離心管內分別加入10×Buffer Cocktail 20 μL、Cocktail of DNases 7 μL、 Micrococcal Nuclease 5 μL、RNase A 2 μL及混合血清166 μL，混勻后37 ℃ 反應60 min，反應至30 min時輕輕混勻幾次使反應充分。

1.4病毒核酸提取 采用病毒核酸提取對核酸酶消化處理后的標本進行病毒核酸提取，最后病毒核酸溶于50 μL buffer AVE中再加入0.5 μL RNA酶抑制劑，混勻冰上放置待用。

1.5反轉錄及合成雙鏈DNA 應用SuperScript Ⅲ反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，取4支無RNA酶的聚合酶鏈反應(PCR)管分別加入dNTP(10 nmol/L)1 μL、含接頭的6堿基隨機引物(100 μmol/L) 1 μL、RNA 1 μL，渦旋混勻后瞬時離心后置于PCR儀上，65 ℃ 反應5 min，迅速置于冰上>2 min。隨后向各管中分別加入Buffer Cocktail 4 μL、ScriptⅢ?RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL、DTT 1 μL,渦旋混勻后瞬時離心后，于25 ℃ 10 min、50 ℃ 60 min、85 ℃ 5 min、95 ℃ 2 min后迅速置于冰上放置≥2 min。再向各反應管中加入Klenow酶1 μL，渦旋混勻后瞬時離心，置于PCR儀上進行37 ℃ 60 min，75 ℃ 20 min反應。最后將得到的雙鏈DNA產物保存待用。

1.6構建病毒文庫 取4支無RNA酶的PCR管分別加入10 μL TD buffer、5 μL ATM及5 μL雙鏈DNA，混勻后2 100 r/min離心1 min后置于PCR儀上進行55 ℃、5 min反應，反應結束后當溫度降至10 ℃時迅速向每管中加入5 μL NT buffer，混勻，2 100 r/min離心1 min。隨后分別轉移至4個預先分別加有Illumina index primer(5 μL N primer和5 μL S primer)和15 μL NPM buffer的混合液中混勻，2 100 r/min離心1 min，置于PCR儀上進行72 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、94 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共15個循環；72 ℃ 5 min反應，即得到病毒文庫。

1.7篩選DNA片段 使用Qiaquick公司生產的PCR核酸純化試驗盒純化病毒文庫以去除引物二聚體。隨后利用Ampure磁珠(Beads)對病毒文庫DNA長度進行篩選：取4支1.5 mL離心管分別向各管加入30 μL文庫DNA和27 Beads，加樣槍上下輕輕混勻，室溫靜置5 min，隨后再置于磁力架上5 min后吸棄上清液。再向管內加入80%乙醇溶液500 mL的洗滌Beads，洗滌2次后吸棄乙醇溶液，打開管口室溫靜置5 min，使乙醇完全揮發。隨后從磁力架上取下離心管加入30 μL無菌水，加樣槍上下輕輕混勻，靜置2 min。再將離心管置于磁力架上靜置3 min,吸取20 μL上清液于0.2 mL的PCR管中用于Miseq測序。

1.8Miseq深度測序及生物信息學分析應用 Illumina測序平臺對文庫進行Miseq深度測序，隨后將測序原始數據傳至美國加州大學舊金山分校，通過其病毒宏基因組學分析平臺對原始數據進行生物信息學分析。應用Bowtie 2軟件濾除數據中真核及原核基因組序列。再應用Phred、VecScreen CAP3、meta-Velvet、ABySS和SOAPdenovo 2等一系列軟件實施序列尾部剪切、引物序列和接頭去除、序列拼接等操作。隨后將序列放入本地病毒蛋白組數據庫中進行BLASTx搜索。再將所有可能為病毒基因的核酸序列放在平臺內的NVNR蛋白組數據庫中進行BLASTx搜索，最后篩選出病毒核酸序列。

2 結 果

2.1各文庫中病毒群落組成 對4個病毒文庫中病毒群落序列進行整理，文庫HCV01、HCV02、HCV03、HCV04中病毒群落構成見圖1～4。數據顯示，HCV01文庫中總病毒序列數為1 514條，主要由黃病毒科(Flaviviridae)48%、指環病毒科(Anelloviridae)29%、未分類科病毒(None)8%、反轉錄病毒科(Retroviridae)7%、微小噬菌體科(Microviridae)2%構成；HCV02文庫中總病毒序列數為2 820條，主要由Anelloviridae 61%、Flaviviridae 18%、Retroviridae 8%、None 3%、Microviridae 1%構成；HCV03文庫中總病毒序列數為3 539條，主要由Anelloviridae 78%、None 5%、Flaviviridae 4%、Retroviridae 4%、人類內源性反轉錄病毒科(HERV)2%、Microviridae 1%構成；HCV04文庫中總病毒序列數為3 549條，主要由Anelloviridae 90%、None 4%、Retroviridae 2%、藻類脫氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)1%、其他病毒科1%構成。

圖1 HCV01病毒群落構成

圖2 HCV02病毒群落構成

圖3 HCV03病毒群落構成

圖4 HCV04病毒群落構成

2.2HCV序列檢測 HCV01和HCV03文庫中分別檢測到的719條、138條Flaviviridae序列均為HCV序列；HCV02文庫中檢測到的515條Flaviviridae序列中有504條為HCV序列，11條為瘟疫病毒(Pegivirus)；HCV04文庫中檢測到的3條Flaviviridae序列均為Pegivirus。

2.3各文庫中病毒群落構成比較 見表2。

表2 各文庫中病毒群落構成比較(n)

3 討 論

傳統研究病毒的方法具有一定的局限性，如PCR只能擴增已知病毒或低變異病毒，而高變異病毒及未知序列病毒此法則難以實施；血清學方法則難以獲得新病毒的特異抗體；細胞培養法，很多病毒缺乏特異的細胞系及大多數病毒不能進行細胞培養。病毒宏基因組學專注于病毒群體，能夠檢測標本中已知和未知病毒再發現新病毒，在檢測病毒流行情況方面展現出強大的優勢。

本研究應用病毒宏基因組學方法對江蘇省泰州地區健康者及HCV-RNA陽性患者血清病毒群落組成進行研究。結果顯示，4個病毒文庫中Flaviviridae序列水平由多至少分別是HCV01、HCV02、HCV03、HCV04，該結果與HCV-RNA檢測結果相符。文庫HCV04為健康對照組，該文庫中僅檢測到3條Flaviviridae序列為Pegivirus；4個文庫中總病毒序列數及Anelloviridae病毒序列數由多至少分別是HCV04、HCV03、HCV02、HCV01，這可能是由于血清中高HCV水平抑制了Anelloviridae病毒的復制，從而導致文庫中Anelloviridae病毒序列水平與HCV水平呈相反現象。4個文庫中Anelloviridae病毒序列均占有相當大的比例，除文庫HCV01外，其他3個文庫中Anelloviridae病毒序列數最多，說明正常情況下Anelloviridae病毒是構成血液中病毒群落的主體。

ABUODEH等[5]研究顯示，人類感染Anelloviridae病毒可高達90%，說明人類普遍感染Anelloviridae病毒，可能該病毒科病毒是人體內的正常病毒群落。近年來，一定數量的新型Anelloviridae病毒被發現，且這些新型病毒可能與人類的某些疾病有一定關系。如GALMS等[6]研究顯示，Anelloviridae病毒的一種新型TTMV病毒可能與嚴重的兒童肺炎有關；ZHANG等[7]通過對患有慢性牙齦炎孕婦的研究發現了一種新的Anelloviridae，并發現該病毒可能與牙齦炎的發生有密切關系。ALAVI等[8]研究顯示，Anelloviridae與丙型肝炎有一定關系，但其對肝臟的影響甚微。本研究中Anelloviridae序列構成了病毒文庫的主體，該病毒科中是否存在一些新型的并與疾病相關的病毒還有待進一步研究。同時，丙型肝炎患者血清中是否存在與疾病相關的其他未知的病毒還需要今后的深入研究。

目前病毒宏基因組學已廣泛應用于很多領域，但還存在很多技術難題和缺陷。(1)標本過濾處理時導致病毒顆粒的丟失[9]。(2)核酸酶不能完全消化游離核酸，從而增加了測序成本及對測序數據分析的難度[10]。(3)目前病毒宏基因組學方法成本高、歷時長，作為緊急檢測方法應用于臨床檢測還有很大難度。(4)一次測序獲得的數據有限，如標本量較多，就會導致部分數據被掩蓋；反之，如標本量較少，則增加了測序成本。相信隨著科技的不斷進步，以上技術難題將會逐步得以解決，病毒宏基因組學技術將來一定能夠成為臨床上的常規檢測項目，更好地為人類的健康生活服務。

[1]KRABERGER S,ARGüELLO-ASTORGA G R,GREENFIELD L G,et al.Characterisation of a diverse range of circular replication-associated protein encoding DNA viruses recovered from a sewage treatment oxidation pond[J].Infect Genet Evol,2015,31(1):73-86.

[2]楊凡力，王意銀，鄭文成，等．中國部分地區蝙蝠攜帶病毒的宏基因組學分析[J]．生物工程學報，2013，29(5)：586-600．

[3]ZHANG W,LI L,DENG X,et al.What is for dinner? Viral metagenomics of US store bought beef,pork,and chicken[J].Virology,2014,9(16):303-310.

[4]GAYET-AGERON A,COMBESCURE C,LAUTENSCHL-AGER S,et al.Comparison of diagnostic accuracy of PCR targeting the 47-Kilodalton protein membrane gene of treponema pallidum and PCR targeting the DNA polymerase Ⅰ gene:systematic review and meta-analysis[J].J Clin Microbiol,2015,53(11):3522-3529.

[5]ABUODEH R,AL-MAWLAWI N,AL-QAHTANI A A,et al.Detection and genotyping of torque teno virus (TTV)in healthy blood donors and patients infected with HBV or HCV in Qatar[J].J Med Virol,2015,87(7):1184-1191.

[7]ZHANG Y,LI F,SHAN T L,et al.A novel species of torque teno mini virus(TTMV) in gingival tissue from chronic periodontitiis patients[J].Sci Rep,2016,25(6):26739.

[8]ALAVI S,SHARIFI Z,VALESHABAD A K,et al.Clinical outcomes of Torque teno virus-infected thalassemic patients with and without hepatitis Cvirus infection[J].Korean J Hematol,2011,46(2):123-127.

[9]THURBER R V,HAYNES M,BREITBART M,et al.Laboratory procedures to generate viral metagenomes[J].Nat Protoc,2009,4(4):470-483.

[10]DJIKENG A,HALPIN R,KUZMICKAS R,et al.Viral genome sequencing by random priming methods[J].BMC Genomics,2008,9(1):5-9.