乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達水平及其與乳腺癌發生和發展的關系

王 剛，廖翠屏，劉 敏，溫亞楠

(四川省成都市溫江區婦幼保健院檢驗科 611130)

人乳腺球蛋白是由乳腺癌上皮細胞克隆而來的乳腺癌相關蛋白，其在約85%的乳腺癌中呈過高表達，但并不表達于其他癌組織，因此有較高的乳腺癌組織特異性[1-2]。本研究選取乳腺癌組織、癌旁正常組織及乳腺良性病變組織標本，通過免疫組化方法、組織微陣列技術及反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)對上述組織標本中人乳腺球蛋白及其mRNA表達水平進行檢測，分析其表達水平與乳腺癌臨床病理特征的相關性，分析其與乳腺癌發生和發展的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2015年1月至2017年8月乳腺癌組織(A組)、癌旁正常組織(B組)及乳腺良性病變組織(C組)標本各40例。A組患者年齡24～65歲，平均(49.95±6.57)歲；B組患者年齡21～68歲，平均(51.06±7.47)歲；C組患者年齡22～69歲，平均(50.63±7.48)歲。3組的年齡、病理分型等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。40例乳腺癌的病理分型：浸潤型35例，非浸潤型5例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期21例，Ⅲ期7例，Ⅳ期1例；發生腋窩淋巴結轉移24例。本研究內容已通過本院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1RT-PCR引物設計 按照人乳腺球蛋白mRNA序列，通過Primer Premier 5.0軟件對PCR引物上、下游序列進行設計，其中人乳腺球蛋白mRNA引物序列長度為320 bp，β-actin序列長度為490 bp；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成和純化。

1.2.2RT-PCR檢測 采用Trizol提取液一步法提取細胞總RNA。并通過一步法進行RT-PCR操作，嚴格按照PCR試劑盒(購自上海吉瑪制藥技術有限公司)說明書進行檢測。反應條件：94 ℃預變性5 min，以相同溫度進行變性30 s，58 ℃退火40 s，共進行40個循環；循環結束后，在62 ℃延伸3 min，72 ℃總延伸5 min；反轉錄合成cDNA(Quit eDNA第一鏈合成試劑盒)，將β-actin作為內參照。根據PCR擴增儀(購自美國ABI公司，型號2720型)及SYBRGreen試劑盒說明書完成操作，其反應條件為：94 ℃預變性5 min，以相同溫度變性30 s，58 ℃退火30 s，共進行40個循環；循環結束后，在62 ℃延伸60 s，68 ℃總延伸3 min。

1.2.3免疫組化檢測 全部標本均經10%中性甲醛進行固定處理，并用石蠟進行包埋，制成微陣列芯片(孔徑3 mm，含40個組織芯)，4 mm切片；選用2張用于免疫組織化學染色，另選1張用于HE染色；通過磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照，嚴格按試劑盒說明書完成相應操作。

1.3免疫組化結果判讀標準[3]人乳腺球蛋白陽性定義：胞漿、細胞膜存在棕色顆粒，反之為陰性。隨機選取10個高倍視野，觀察陽性細胞的染色強度，0分：無顯色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。并對陽性細胞在總細胞數所占百分比進行評分，陰性：0分；陽性細胞在25%及以下：1分；陽性細胞>25%～50%：2分；陽性細胞>50%～75%：3分；陽性細胞>75%～100%：4分。將陽性細胞的染色強度及其百分比得分相加，其中0～3分為陰性，>3～7分為陽性。

2 結 果

2.13組人乳腺球蛋白陽性結果及其mRNA表達水平比較 見表1。A組人乳腺球蛋白陽性率明顯高于B、C組，且其mRNA表達水平也明顯高于B、C組，差異均有統計學意義(P<0.05)；而B組與C組mRNA表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 3組人乳腺球蛋白陽性結果及其mRNA表達水平比較

注：與B、C組比較，*P<0.05

2.2乳腺癌組織中人乳腺球蛋白陽性率與臨床病理特征的相關性 見表2。乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達與組織學分級、淋巴結轉移及雌激素受體(ER)水平均密切相關(P<0.05)，其中組織學分級為Ⅱ～Ⅲ級、發生腋窩淋巴結轉移及ER陽性者人乳腺球蛋白的陽性率明顯高于組織學分級為Ⅰ級、無淋巴結轉移及ER陰性者；而人乳腺球蛋白陽性率與病理類型、TNM分期、腫瘤大小及孕激素受體(PR)均無明顯相關性(P>0.05)。

表2 乳腺癌組織中人乳腺球蛋白陽性率與臨床病理特征的相關性[n(%)]

續表2 乳腺癌組織中人乳腺球蛋白陽性率與臨床病理特征的相關性[n(%)]

2.3多因素Logistic回歸分析結果 見表3。將乳腺癌組織中人乳腺球蛋白作為因變量，臨床病理特征各項指標作為自變量進行多因素Logistic回歸分析。提示乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達與組織學分級、PR及ER水平均存在明顯關系(P<0.05)。

表3 多因素Logistic回歸分析結果

3 討 論

遠處轉移是引起乳腺癌患者死亡的主要因素之一。有研究報道，早期乳腺癌不排除遠處轉移的可能性[4-5]。近年來，腫瘤標志物廣泛應用于腫瘤的診斷、療效及預后評價中，并且也廣泛用于高危人群的隨訪研究中。其中糖類抗原153(CA153)、癌胚抗原(CEA)及CA125均為目前臨床常用的腫瘤標志物，但因其靈敏度和組織臟器特異度通常低于25%，因此并非是診斷乳腺癌和疾病復發、轉移的確切指標[6-8]。所以，探索一種或多種更為確切有效的乳腺癌特異性標志物對提高疾病的準確率及轉移判斷顯得尤為重要。人乳腺球蛋白是經93個氨基酸序列組合而成，其基因處于染色體11q13。既往有研究指出，人乳腺球蛋白有理想的乳腺癌組織特異度，可作為診斷乳腺癌的重要指標[9]。

本研究采用RT-PCR和免疫組織化學法對乳腺癌組織、癌旁正常組織及乳腺良性病變組織中人乳腺球蛋白及其mRNA表達情況進行檢測發現，A組人乳腺球蛋白陽性率明顯高于B、C組，并且其mRNA表達水平也明顯高于B、C組；但B組與C組及其mRNA表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，與文獻[10-11]研究報道吻合。本研究結果表明，人乳腺球蛋白及其mRNA在乳腺癌組織中表達較高，在癌旁正常組織的表達較低，而在乳腺良性病變組織中并無表達。此外，本研究發現，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達與組織學分級、淋巴結轉移及ER均密切相關，其中組織學分級為Ⅱ～Ⅲ級、發生腋窩淋巴結轉移及ER陽性者人乳腺球蛋白的陽性率明顯高于組織學分級為Ⅰ級、無淋巴結轉移及ER陰性者，與文獻[12]報道一致；而人乳腺球蛋白陽性率與病理類型、TNM分期、腫瘤大小及PR均無明顯相關性。多因素Logistic回歸分析發現，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達與組織學分級、PR及ER均存在明顯關系。本研究結果表明，組織學分級、PR及ER可能是人乳腺球蛋白表達的影響因素，可進一步推斷人乳腺球蛋白可能在乳腺癌的發生、發展過程中發揮一定作用，并且隨著其表達水平升高，腫瘤分化程度加重，進而導致其惡性程度升高、腫瘤侵襲性提高。所以，人乳腺球蛋白可能是評估乳腺癌腫瘤侵襲能力及惡性程度的重要指標。

目前，有關人乳腺球蛋白的表達水平與乳腺癌ER、PR相關性的看法尚未明確，但有研究指出，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的陽性率與ER并無明顯關系，而與PR存在明顯關系[13]。另有研究指出，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的陽性率與ER存在明顯關系，而與PR并無明顯關系[14-15]。本研究結果表明，人乳腺球蛋白陽性率與ER密切相關，而與PR陽性與否并無明顯關系；進一步采用多因素Logistic回歸分析發現，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達與PR及ER均存在明顯關系。與上述研究存在爭議的原因可能因χ2檢驗是獨立樣本量百分率的基因，并不會受混雜因素的影響；而Logistic回歸分析作為多變量分析方法之一，是分析二分類觀察結果與某些因素間的關系，所以其受混雜因素的干擾較大。并且，雌二醇作為孕酮受體合成的啟動因素，PR需在ER存在時才能起到一定作用。所以，單獨PR陽性表達可能對人乳腺球蛋白表達的影響較小，故二者并未存在密切聯系。但PR與ER同時呈陽性表達時可能起到彼此協同作用而使人乳腺球蛋白表達水平升高、陽性率升高，但有關具體影響機制尚未定論，仍需今后進一步探討。

綜上所述，人乳腺球蛋白在乳腺癌組織中呈高表達，并且其與組織學分級、PR及ER密切相關，其可能參與乳腺癌的發病過程，可作為評估患者腫瘤侵襲能力及惡性程度的重要指標。

[1]LAPEIRE L,DENYS H,COCQUYT V,et al.When fat becomes an ally of the enemy:adipose tissue as collaborator in human breast cancer[J].Horm Mol Biol Clin Investig,2015,23(1):21-38.

[2]侯永強，劉金彪，王新征，等．人乳腺球蛋白在乳腺癌中的表達及臨床意義[J]．實用醫學雜志，2012，28(9)：1572-1573．

[3]何子平，陳瓊駒，歐陽思旗，等．乳腺癌患者中乳腺球蛋白的表達及其臨床意義[J]．中國當代醫藥，2013，20(14)：79-80．

[4]COLDITZ G A,BOHLKE K,BERKEY C S.Breast cancer risk accumulation starts early:prevention must also[J].Breast Cancer Res Treat,2014,145(3):567-579.

[5]胡園園，陳旭，劉佩佩，等．乳腺珠蛋白在乳腺癌中的研究進展[J]．現代腫瘤醫學，2017，25(17)：2836-2839．

[6]許建華．乳腺癌前哨淋巴結中hMAM mRNA的檢測及其臨床意義[J]．中國普通外科雜志，2012，21(11)：1456-1458．

[7]AZAB B N,BHATT V R,VONFROLIO S,et al.Value of the pretreatment albumin to globulin ratio in predicting long-term mortality in breast cancer patients[J].Am J Surg,2013,206(5):764-770.

[8]ROSE D P,GRACHECK P J,VONA-DAVIS L.The interactions of obesity,inflammation and insulin resistance in breast cancer[J].Cancers(Basel),2015,7(4):2147-2168.

[9]SAMAVAT H,KURZER M S.Estrogen metabolism and breast cancer[J].Cancer Lett,2015,356(2):231-243.

[10]左思，楊偉萍，韋長元，等．細胞角蛋白19和人乳腺球蛋白在乳腺癌陰性前哨淋巴結中的表達及臨床意義[J]．實用老年醫學，2012，26(3)：242-244．

[11]侯永強，劉金彪，王新征，等．人乳腺球蛋白及Ki-67在乳腺癌中的表達及臨床意義[J]．河南科技大學學報(醫學版)，2012，30(1)：15-17．

[12]CHANG Y W,SINGH K P.Long-term exposure to estrogen enhances chemotherapeutic efficacy potentially through epigenetic mechanism in human breast cancer cells[J].PLoS One,2017,12(3):e0174227.

[13]黃英，劉新蘭，厚玉瑾，等．hMAM,VEGF-C 和 VEGF-D 在乳腺癌原發灶及腋淋巴結中的表達[J]．廣東醫學，2016，37(1)：117-119．

[14]何凡，阮劍，寧曉潔，等．RT-PCR檢測人乳腺球蛋白在乳腺癌SLN微轉移灶檢出率及假陰性作用分析[J]．實用臨床醫藥雜志，2017，21(11)：90-93．

[15]ROSE D P,VONA-DAVIS L.Biochemical and molecular mechanisms for the association between obesity,chronic inflammation,and breast cancer[J].Biofactors,2014,40(1):1-12.