atRA對大鼠結腸炎中TGF-β1/Smad3通路的作用研究

蘇玉清，王 烜

0 引言

過度激活的免疫炎癥反應與抗免疫炎癥反應之間的失衡，是導致炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)炎癥持續存在的重要機制之一[1]。機體中這種對抗過強的炎癥反應主要通過TGF-β1/Smad3通路實現[2]。但IBD中，該通路受損[3]：即IBD患者體內TGF-β1較正常人升高，但由于高表達的Smad7蛋白抑制了該通路中的Smad3磷酸化為pSmad3，使得TGF-β1不能正常發揮其免疫抑制作用，導致炎癥持續存在[4-5]，修復該通路，理論上即可達到緩解結腸炎癥狀的目的。

全反式維甲酸能夠在炎癥狀態下維持TGF-β1對Treg形成的誘導，防止其向Th17轉化；同時維持Foxp3的持續表達[6]，而Treg是IBD中起免疫抑制的重要細胞之一。atRA與TGF-β1在Treg細胞的特異性轉化因子Foxp3的生成上有協同作用[7]。atRA可增加Smad3基因的表達。在體外模擬的炎癥狀態下，全反式維甲酸單獨干預僅能誘導Smad3 mRNA的轉錄，但不改變pSmad3的含量，但加入TGF-β1，可增加pSmad3的含量[8]。因此，鑒于免疫-抗免疫失衡在IBD中的重要作用，本實驗就atRA是否能通過修復TGF-β1/Smad3信號通路，達到緩解結腸炎癥狀的目的，進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 動物 SD大鼠購自西南醫科大學實驗動物中心，雄性，體重(220±20)g。

1.2 主要實驗器材及試劑 三硝基苯磺酸(5%TNBS)(美國Sigma公司)；全反式維甲酸片(山東來福制藥有限公司)，美沙拉嗪(法國愛的發制藥集團)，無水乙醇、異丙醇(國藥集團)；IL-17 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒(北京誠林生物有限公司)；Smad7兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森有限公司)；pSmad3兔抗鼠多克隆抗體(Bioworld)；PCR儀(杭州博日科技)；免疫組化染色儀(美國Ventana公司)；全自動酶標儀(芬蘭Thermo公司)。

1.3 方法 實驗動物編號后，用隨機數字表法分為5組：對照組(C組)，造模組(TNBS組)，美沙拉嗪組(M組)，全反式維甲酸組(A組)，全反式維甲酸+美沙拉嗪組(MA組)，適應性飼養1周，予TNBS/無水乙醇灌腸液(100 mg/kg)造模。24 h后，予不同藥物灌胃：①C組及TNBS組(2 mL生理鹽水)；③M組(30 mg/kg)；④A組(20 mg/kg)；⑤MA組(為上述二者的聯合)。

2 固定、取材、測指標

2.1 取材 于造模后每天行DAI積分(參照Osman N等標準)：①體重：不下降或升高計0分，下降1%～5%計1分，下降6%～10%計2分，11%～15%計3分，>15%計4分；②大便：正常計0分，半稀便計2分，稀便計4分；③隱血：陰性計0分，陽性計2分，出現肉眼血便計4分。8 d后，心臟負壓采血5 mL，提取血清儲存，待用ELISA法檢測用。處死大鼠，肉眼觀察結腸大體觀。取病變明顯的結腸組織行病理切片及免疫組化實驗及QT-PCR實驗。

2.2 相關指標的檢測

2.2.1 HE染色及切片觀察 結腸組織經固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、透明，封片，觀察病理改變，行TDI評分。0分：沒有損傷；1分：較弱的黏膜和黏膜下炎癥浸潤和充血水腫，黏膜輕度糜爛，而黏膜肌層保持完整；2分：在1分的基礎上，范圍達標本的50%以上；3分：顯著的炎癥浸潤和充血水腫，潰瘍延伸到黏膜下層和黏膜肌層，較少的炎癥細胞浸潤固有層，無肌層壞死；4分：在3分的基礎上，范圍達標本的50%及以上；5分：廣泛的潰瘍形成，伴有壞死，細胞壞死達黏膜固有肌層；6分：在5分的基礎上，范圍達標本的50%及以上。

2.2.2 免疫組化測定Smad7、pSmad3水平 組織脫蠟、水化，封閉，滴加羊抗大鼠Smad7、pSmad3多克隆抗體，滴加生物素化的兔抗羊抗體室溫孵育，DAB顯色，蒸餾水終止反應，顯微鏡高倍鏡下(×400)隨機選取5個視野，在相同條件下拍攝并用Image-proplus(IPP)6.0圖像分析軟件測定積分光密度(Integrated option density，IOD)。

2.2.3 ELISA檢測IL-17、TNF-α水平 按ELISA試劑盒進行試驗，測定各孔的吸光度(OD值)。繪制標準曲線，計算多項式二次回歸方程，計算樣品的實際濃度。

2.2.4 QT-PCR檢測TGF-β1、Smad7水平 取約100 mg組織，按RNA提取試劑盒提取RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒測定mRNA，反應程序：95 ℃預變性1 min,95 ℃循環(40次),溶解曲線60 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃;反應體系為：2×qPCR Mix 5.0 μL,引物工作液1.0 μL,Template 1.0 μL,ddH2O 2.8 μL,Rox 0.2 μL(引物見表1)。

3 結果

3.1 模型建立及一般形態觀察 造模后所有大鼠均出現水樣、糊狀稀便，以及精神萎靡，懶動，進食少，毛色臟亂，對刺激反應遲鈍，造模后第2、3天，個別大鼠解鮮紅色血便。予以干預后，在造模后第4天M組和MA組大鼠糞便好轉，A組在造模后第5天出現糞便好轉。至實驗結束(即造模后第8天)，模型組死亡大鼠2只，其中1只解剖后考慮腸壞死；另1只考慮炎癥過重導致。M組及A組各死亡1只，前者推測為灌胃時藥物誤入氣管導致窒息，后者則是炎癥過重所致。C組無大鼠死亡，毛色光亮，體重增加(見圖1)。

3.2 結腸大體觀 C組無充血、水腫、狹窄，腸壁蠕動好，與周圍組織無黏連。模型組大鼠結腸局部嚴重狹窄、僵硬，腸段縮短，腸段可見多個散在表面附有臟苔之潰瘍面，周圍黏膜充血、水腫、糜爛，與周圍組織嚴重黏連，無法分離。M組及A組大鼠結腸局部有黏連、輕度狹窄，但腸蠕動可，未見明顯深凹潰瘍面。MA組結腸局部黏連輕，腸段長度基本正常，腸壁蠕動好(見圖2)。

3.3 大鼠的DAI積分及體重分析 藥物干預后，各組體重比較差異有統計學意義(F=21.85，P<0.05)；組間比較提示，TNBS組下降最顯著，相較于其他各組差異有統計學意義(P<0.01),A組與M組比較差異無統計學意義(P=0.589),MA組較A組和M組升高(P=0.006、0.02)。DAI積分顯示，藥物干預后，DAI評分較前明顯好轉，其中仍以TNBS組評分最高，各組間DAI積分比較差異有統計學意義(F=67.7,P<0.05)；A組與M組相比，DAI積分差異無統計學意義(P=0.585)，MA組與A組和M組比較差異有統計學意義(P=0.005、0.019)。提示藥物干預緩解了大鼠結腸炎癥狀，以MA組效果最明顯。見表2、圖3。

3.4 大鼠結腸組織病理學觀察 大鼠結腸組織行HE染色后10×10倍顯微鏡下觀察，可見C組各層結構清晰，無潰瘍形成，腺體排列有序，固有層可見少許炎癥細胞。TNBS組可見大量中性粒細胞等炎癥細胞浸潤結腸全層，各層結構及腺體等消失，無法辨認，潰瘍深達肌層。干預后，A組較M組黏膜下層仍有較多炎癥細胞浸潤，但可見修復的黏膜層及杯狀細胞，部分黏膜仍可見淺小潰瘍，各層結構基本能辨認。MA組各層結構可辨識，仍可見到炎癥細胞浸潤，個別腺體排列欠規則，黏膜層基本修復，未見明顯潰瘍面形成。結腸組織病理學評分提示，各組差異有統計學意義(F=26.25，P<0.01)；組間比較，相較于TNBS組，經處理后，各組病理評分均有所好轉(P<0.01)，M組與A組比較差異無統計學意義(2.86±0.69 vs. 3.14±1.34，P>0.05),MA組緩解最明顯，相較于M組、A組，差異有統計學意義(P=0.002、0.009)。見表2、圖4。

表1 引物(由Invitrogen Biotechnology Co,LTD中國公司合成)

圖1 大鼠一般情況

表2 各組大鼠DAI積分、體重及TDI評分比較

組別處死當日DAI積分處死當日體重(g)TDIC組0.00±0.00240.90±7.380.25±0.46TNBS組8.33±1.21*193.82±14.52△4.67±1.03△A組3.29±1.11*209.60±10.87#△2.86±0.69#△M組3.00±1.29*212.53±9.92#△3.14±1.34#△MA組1.71±0.75*225.53±6.89#1.57±0.53#F值67.7821.8526.25P值<0.01<0.01<0.01

注：*與C組比較，P<0.05；#與TNBS組比較，P<0.05；△與MA組比較，P<0.05

3.5 結腸組織QT-PCR檢測TGF-β1及Smad7 mRNA的表達 各組TGF-β1 mRNA比較差異有統計學意義(F=1 421.25，P<0.01),其中TNBS組較C組有所升高(P<0.01)，A組較M組、MA組TGF-β1 mRNA升高更明顯，聯合組為甚，A組與M組比較差異無統計學意義(P=0.427),聯合組較單藥組升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。多組組間分析提示，各組Smad7 mRNA比較差異有統計學意義(F=242.25,P<0.01),TNBS組中表達最高，C組最低，差異有統計學意義(P<0.01)。干預后，相較于TNBS組，其他組Smad7 mRNA表達均下降，以聯合組下降最明顯(P<0.01)，A組與M組比較差異無統計學意義(P=0.586)。提示TNBS組雖然較C組TGF-β1表達增加，但其腸道仍然有很嚴重的炎癥損害，提示在TNBS組中增加的TGF-β1并不能完全發揮其正常的免疫抑制效應從而減輕炎癥。而在結腸炎模型組中，Smad7的轉錄水平較其他組均明顯升高，表明可能是過度表達的Smad7抑制了TGF-β1的這種保護效應。見表3。

圖3 大鼠結腸DAI及TDI直方圖

圖4 大鼠結腸組織病理切片(HE，100×)

表3 各組大鼠TGF-β1/Smad3通路蛋白mRNA水平比較

注：*與MA組比較，P<0.05；#與TNBS組比較，P<0.05

3.6 ELISA法檢測血清中的IL-17、TNF-α水平 多組組間分析提示各組IL-17比較差異有統計學意義(F=85.94，P<0.01),以TNBS組最高，差異有統計學意義(P<0.01)，C組最低。干預后，各藥物組較TNBS組均有明顯下降(P<0.01)，相較于A組和M組，MA組下降最明顯(P=0.008、0.022)。各組間TNF-α比較差異有統計學意義(F=74.13，P<0.01)，以TNBS組最高，差異有統計學意義(P<0.01)，C組最低(P<0.01)，MA組下降最明顯(相較于A組及M組，P=0.001、0.002)。提示，經藥物干預后，各組炎癥較TNBS組有緩解，MA組效果明顯，但仍未達C組水平。見表4。

3.7 免疫組織化學檢測Smad7、pSmad3蛋白的表達 免疫組織化學方法提示，這2種蛋白主要表達于固有層免疫細胞，胞質和部分細胞核表現為棕黃色為陽性細胞。IPP-6測定IOD，Smad7在TNBS組表達最高，差異有統計學意義(P<0.01)；干預后，各組均有所下降，以MA組下降最明顯。多組組間pSmad3蛋白表達水平比較差異有統計學意義(F=273.39，P<0.01)；兩兩比較提示，相較于其他各組，C組表達最高(P<0.01)，A組與M組pSmad3表達差異無統計學意義(P=0.397)，MA組較A組和M組升高(P<0.01)，TNBS組積分光密度值最低。見表5、圖5～圖7。

表4 各組血清炎癥因子水平比較

注：*與MA組比較，P<0.05；#與TNBS組比較，P<0.05

表5 各組大鼠Smad7、pSmad3蛋白IOD值比較

注：*與MA組比較，P<0.05；#與TNBS組比較，P<0.05

圖5 大鼠結腸組織中Smad7、pSmad3蛋白IOD直方圖

3 討論

炎癥性腸病的發病原因尚不完全清楚,在發病過程中，多種炎癥通路(NF-κB通路、MAPKs通路等)的激活，以及多種致病性免疫細胞(Th1細胞、Th17細胞等)的活化，釋放出大量炎癥因子，如IL-17、TNF-α、IL-6、IL-23等，引發腸道黏膜損傷，導致一系列臨床癥狀如腹痛、黏液血便等的出現[9-10]。對于一般的免疫炎癥反應，機體存在保護性的對抗機制，即抗免疫炎癥反應，目的是減少過度激活的炎癥反應持續存在造成組織損傷，但是在IBD中，這種對抗機制被削弱。因此，增強或恢復機體本身存在的抗免疫炎癥反應可成為一種新的治療途徑。在炎癥性腸病中，這種抑制作用主要通過TGF-β1/Smad3通路來實現，TGF-β1與TβRⅠ-TβRⅡ異二聚體結合，活化TβRⅠ，后者吸引Smad2/Smad3結合并將其磷酸化，活化的pSmad2/Smad3與Smad4結合,共同入核，啟動下游目的基因的轉錄，發揮免疫抑制效能。Smad7通過作用于TβRⅠ從而阻斷Smad2/Smad3磷酸化而活化，最終遏制該通路下游基因的轉導[3]。在炎癥性腸病中，過度表達的Smad7阻斷了該通路的正常轉導，導致抗炎因子生成減少，從而使得過度激活的炎癥反應失去控制。

圖6 大鼠結腸組織中Smad7蛋白(免疫組化，400×)

圖7 大鼠結腸組織中Smad3蛋白(免疫組化，400×)

在本實驗中，TNBS組TGF-β1高于C組，TGF-β1是體內免疫抑制作用最強的因子，但是在如此高表達水平下，TNBS組仍出現不可控的炎癥反應，說明TNBS組大鼠體內的TGF-β1并沒有完全發揮其免疫抑制作用。隨后，我們研究了TGF-β1最重要的通路TGF-β1/Smad3；QT-PCR結果顯示，C組的Smad7 mRNA較TNBS組下降。進一步采用免疫組織化學檢測了Smad7、pSmad3的表達，結果提示，C組Smad7遠低于模型組，而pSmad3遠高于TNBS組，提示TNBS結腸炎模型中存在TGF-β1/Smad3的受損。這與之前的研究結果一致[3]。

經全反式維甲酸干預后，與TNBS組比較，在癥狀、病理等方面均得到改善，提示全反式維甲酸對結腸炎有治療作用。進一步的結果提示，與TNBS組比較，QT-PCR顯示，全反式維甲酸可以抑制Smad mRNA水平，免疫組織化學結果提示，Smad7蛋白在atRA組明顯減少，這種減少可能是通過基因轉錄層面實現的。Smad7的減少間接引發pSmad3的表達量顯著上調，這提示全反式維甲酸可能通過修復TGF-β1/Smad3通路發揮緩解作用。進一步檢測該通路下游的炎癥因子水平也支持這種推測。

將A組與目前用于治療炎癥性腸病的一線藥物美沙拉嗪比較，兩者的治療效果大體相似，包括DAI、結腸大體外觀及TDI積分在內的統計結果，TGF-β1/Smad3通路的蛋白轉錄和表達水平，以及該通路下游的炎癥因子的濃度，兩者差異均無統計學意義。但是Rousseaux等[11]已經證實，美沙拉嗪是已經明確了的PPARγ新型配體，其作用靶點并不是TGF-β1/Smad3通路。因此，推測出現這種結果的原因可能是：TGF-β1/Smad3通路中的Smad蛋白(包括Smad7和Smad3在內)作為體內多種炎癥通路(JNK通路、NF-κB通路等)的交匯點，通過其可以影響各炎癥通路的表達水平，各炎癥通路也可以反過來調節TGF-β1/Smad3通路，包括上調或下調Smad蛋白表達量[12]。因此，美沙拉嗪作用于PPARγ-NF-κB通路，使得炎癥反應減輕，下調了Smad7蛋白的表達。

與單用藥組比較，MA組的治療效果更好。MA組Smad7 mRNA、Smad7蛋白的表達明顯少于單一用藥組，而pSmad3則較高。既往研究證明，美沙拉嗪的作用靶點是PPARγ。PPARγ被配體激活后,必須先與視黃酸X受體α(RXRα)結合形成PPARγ/RXRα異二聚體,然后才能與靶基因的特異性DNA序列結合，激活并介導靶基因轉錄。atRA擁有與9-cis-RA相似的RXRα激活特性，PPARγ配體(美沙拉嗪)和RXRα配體(atRA)的雙重激活能使異二聚體發揮更強的轉錄因子活性[13-14]。因此，聯合使用美沙拉嗪+全反式維甲酸這兩種作用靶點不同但又具有協同作用的藥物，可能是治療效果更好的原因。

參考文獻：

[1] Bamias G,Pizarro TT,Cominelli F,et al.Pathway-based approaches to the treatment of inflammatory bowel disease[J] .Transl Res,2016,167(1):104-115.

[2] Yang X,Letterio JJ,Lechleider RJ,et al.Targeted disruption of SMAD3 results in impaired mucosal immunity and diminished T cell responsiveness to TGF-.Beta[J] .EMBO J,1999,18:1280-1291.

[3] Monteleone G,Kumberova A,Croft NM,et al.Blocking Smad7 restores TGF-beta1 signaling in chronic inflammatory bowel disease[J] .J Clin Invest,2001,108(4):601-609.

[4] Zorzi F,Calabrese E,Monteleone I,et al.A phase 1 open-label trial shows that smad7 antisense oligonucleotide (GED0301) does not increase the risk of small bowel strictures in Crohn′s disease[J] .Aliment Pharmacol Ther,2012,36(9):850-857.

[5] Biancheri P,Giuffrida P,Docena GH,et al.The role of transforming growth factor (TGF)-β in modulating the immune response and fibrogenesis in the gut[J] .Cytokine Growth Factor Rev,2014,25(1):45-55.

[6] Zhou X,Kong N,Wang J,et al.Cutting edge:all-trans retinoic acid sustains the stability and function of natural regulatory T cells in an inflammatory milieu[J] .J Immunol,2010,185(5):2675-2679.

[7] Xiao S,Jin H,Korn T,et al.Retinoic acid increases Foxp3+ regulatory T cells and inhibits development of Th17 cells by enhancing TGF-beta-driven Smad3 signaling and inhibiting IL-6 and IL-23 receptor expression[J] .J Immunol,2008,181(4):2277-2284.

[8] Pendaries V,Verrecchia F,Michel S,et al.Retinoic acid receptors interfere with the TGF-beta/Smad signaling pathway in a ligand-specific manner[J] .Oncogene,2003,22(50):8212-8220.

[9] Marafini I,Di FD,Calabrese E,et al.Antisense approach to inflammatory bowel disease:prospects and challenges[J] .Drugs,2015,75(7):723-730.

[10] Moss AC.Optimizing the use of biological therapy in patients with inflammatory bowel disease[J] .Gastroenterol Rep (Oxf),2015,3(1):63-68.

[11] Rousseaux C,Lefebvre B,Dubuquoy L,et al.Intestinal anti-inflammatory effect of 5-aminosalicylic acid is dependent on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma[J] .J Exp Med,2005,201(8):1205-1215.

[12] Derynck R,Zhang YE.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signalling[J] .Nature,2003,425(6958):577-584.

[13] Mangelsdorf DJ,Ong ES,Dyck JA,et al.Nuclear receptor that identifies a novel retinoic acid response pathway[J] .Nature,1990,345(6272):224-229.

[14] Pirat C,Farce A,Lebègue N,et al.Targeting peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs):development of modulators[J] .J Med Chem,2012,55(9):4027-4061.