一例散發(fā)遺傳性對(duì)稱性色素異常癥ADAR1基因新突變

吉 津 郭 琴 章若畫 李 明

遺傳性對(duì)稱性色素異常癥(Dyschromatosis symmetrica hereditaria DSH)是一種少見(jiàn)的主要表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳的具有高度外顯率色素異常性皮膚病[1]。在日本及中國(guó)的人群中發(fā)病的報(bào)道明顯多于其他國(guó)家，由此可見(jiàn)種族背景似乎是影響其發(fā)病率的主要因素[2]。臨床主要表現(xiàn)為肢端對(duì)稱性的色素沉著及色素減退斑疹，手足背部最為明顯，面部可伴有雀斑樣損害，通常于嬰兒期或童年期起病，亦有遲發(fā)患者的報(bào)道。一旦這些色素異常性皮損形成，往往可持續(xù)終生。日曬后加重，偶有嚴(yán)重者可累及全身，一般無(wú)自覺(jué)癥狀。少數(shù)DSH患者被報(bào)道可伴有一些并發(fā)癥，如：精神衰退、扭轉(zhuǎn)性肌張力障礙、病毒性腦炎、癲癇、顱內(nèi)血管瘤、Perry-Romberg綜合征、1型神經(jīng)纖維瘤、多指(趾)、肢端肥大癥、銀屑病等[1]。定位于染色體1q21.3上的ADAR1基因被鑒定為是本病的致病基因，其編碼雙鏈RNA特異性腺苷酸脫氨酶。至今已有超過(guò)140個(gè)在此基因上的突變被陸續(xù)報(bào)道。筆者對(duì)一例散發(fā)DSH患者進(jìn)行調(diào)查，并利用PCR和直接測(cè)序方法對(duì)其致病基因進(jìn)行突變檢測(cè)，以期發(fā)現(xiàn)其中是否存在ADAR1基因突變。

1 資料和方法

1.1 倫理申明 此研究遵從赫爾辛基宣言的原則，由江蘇省中醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。患者和其雙親，以及100名種族相同的的正常對(duì)照組個(gè)體均在招募和抽血采樣前被告知此研究的目的及簽署知情同意書。患者同意我們的研究可以公布其臨床圖片。

1.2 臨床資料 患者，男，30歲。3歲時(shí)發(fā)病，雙側(cè)手背出現(xiàn)針尖大褐色斑疹，繼之出現(xiàn)色素減退斑疹(圖1)，逐漸增多，增大，至青春期后皮損穩(wěn)定不再增多。雙側(cè)足背無(wú)類似皮損，面部無(wú)雀斑樣損害，訴日曬后皮損可加重，夏重冬輕。除皮膚損害外，無(wú)系統(tǒng)病變。足月產(chǎn)，父母非近親結(jié)婚。其父母皮膚正常。

圖1 雙側(cè)手背部示色素沉著斑間有色素減退斑，足背未見(jiàn)明顯皮損

1.3 方法

1.3.1 外周血基因組DNA提取 采集患者、患者父母外周血3 mL，并采集與本病無(wú)關(guān)的100名正常人外周血3 mL作為對(duì)照，置-70℃冰箱保存。應(yīng)用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德國(guó))提取基因組DNA，標(biāo)化質(zhì)量濃度至10 mg/L。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序 根據(jù)文獻(xiàn)[4]合成13對(duì)引物，不僅包含ADAR1基因的15個(gè)外顯子，而且還包括每個(gè)外顯子兩端至少10個(gè)內(nèi)含子。本文利用此13對(duì)引物全部擴(kuò)增ADAR1基因的15個(gè)外顯子并全部進(jìn)行測(cè)序。其中為擴(kuò)增部分2號(hào)外顯子的引物：上游5’-TCAATG-AGTCTGACTCCTCT-3’。下游5’-GGAAG-GAGG'AAAAGATAGG-3’。PCR反應(yīng)體系為50 μL，上、下游引物各20 pmol/L，dNTP 20 mmoL/L，MgCl215 mmoL/L，Taq酶2.5U。反應(yīng)條件：94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，共33個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠(溴化己錠染色)電泳分析并從瓊脂糖凝膠中回收、純化后經(jīng)ABl3730型全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。將所得序列與GenBank(GenBank 編號(hào)：NM-001111)中人類ADAR1基因的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

患者臨床表現(xiàn)符合DSH，由于患者個(gè)人因素，未能行皮損病理檢查。將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與Genbank中相對(duì)應(yīng)的正常人ADAR1基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)雜合突變，第2號(hào)外顯子1162位堿基由G替換成了T(圖2)，造成編碼氨基酸發(fā)生無(wú)義突變，最終導(dǎo)致第388位氨基酸形成終止密碼子，即P.E388X，由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)將缺失839位氨基酸。而臨床表型正常的患者的父母未發(fā)現(xiàn)突變，表明該突變是一個(gè)新生突變(de novo mutation)，并且本研究檢測(cè)了100名健康對(duì)照均未出現(xiàn)上述突變。以上研究結(jié)果證明筆者發(fā)現(xiàn)的無(wú)義突變(c.1162G>T)是該患者的致病突變而不是單核苷酸多態(tài)性。

圖2 a:正常人ADAR1基因部分序列圖；b:患者雜合無(wú)義突變，c．1162G>T，箭頭所示為突變堿基

剪切突變功能預(yù)測(cè)分析:應(yīng)用 Mutation taster軟件進(jìn)行剪切突變蛋白功能預(yù)測(cè)分析，提示下游氨基酸序列丟失，與野生型相比，蛋白質(zhì)功能可能缺失。此突變未在ExAC nor 1000G數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。

3 討論

遺傳性對(duì)稱性色素異常癥的致病基因ADAR1，也稱為DSRAD基因(double-stranded RNA．specific adenosine deaminase)即雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶，該酶選擇性作用于mRNA前體，將相應(yīng)位點(diǎn)上腺嘌呤核苷(A)脫氨基轉(zhuǎn)換成次黃嘌呤核苷(I)。近期研究顯示ADAR1是固有免疫滅活病毒的重要調(diào)節(jié)因子之一，維持細(xì)胞生存的重要因子[6,7]。由于選擇性的剪接，其產(chǎn)生干擾素介導(dǎo)的或長(zhǎng)形態(tài)p150(表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核)和固有性表達(dá)的或短形態(tài)的p110(主要表達(dá)于細(xì)胞核)ADAR1蛋白質(zhì)，據(jù)推測(cè)在DSH的致病機(jī)制中，P150異構(gòu)體比p110發(fā)揮更重要的作用[8]。

該基因包含15個(gè)外顯子，編碼1226個(gè)氨基酸。該基因至少包含6個(gè)功能區(qū)域：2個(gè)Z-alpha區(qū)、3個(gè)dsRNA結(jié)合區(qū)(DRBM)和1個(gè)酶催化結(jié)構(gòu)域(ADEAMc) 區(qū)；分別位于2號(hào)外顯子、外顯子2-7和外顯子9-15[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，該家系突變位點(diǎn)位于2號(hào)外顯子內(nèi)，該外顯子突變?cè)谀壳皥?bào)道較多，大多數(shù)為無(wú)義突變或移碼突變，少數(shù)為錯(cuò)義突變[1,9,10]。該患者發(fā)生的2號(hào)外顯子的無(wú)義突變(c.1162G>T)導(dǎo)致形成終止密碼子(P.E388X)，使ADAR1基因所編碼的蛋白提前出現(xiàn)終止，導(dǎo)致截短的蛋白，或者可能引起無(wú)義介導(dǎo)的mRNA衰減(NMD)，減少ADAR1蛋白的表達(dá)，造成單倍劑量不足，使黑素母細(xì)胞功能異常，從而產(chǎn)生相應(yīng)的臨床癥狀。

本例患者屬于散發(fā)病例，并且僅有雙側(cè)手背出現(xiàn)皮損，此在DSH患者中報(bào)道較少，值得引起注意。推測(cè)此可能是由于p110異構(gòu)體ADAR1蛋白功能未受影響，彌補(bǔ)了P150異構(gòu)體ADAR1蛋白功能不足的缺陷，但遺憾未能實(shí)驗(yàn)證實(shí)；或此位點(diǎn)突變僅導(dǎo)致患者雙側(cè)手背皮損此種特定表現(xiàn)型的出現(xiàn)亦仍待后續(xù)研究報(bào)道證實(shí)。目前報(bào)道的DSH突變位點(diǎn)超過(guò)140種，但其基因型與表現(xiàn)型的相互關(guān)系及其確切致病機(jī)理仍未明確。組織病理和電鏡顯示色素減退區(qū)域黑素細(xì)胞及黑素小體數(shù)目均少于周圍正常組織，且存在黑素細(xì)胞的空泡化，一個(gè)新的發(fā)現(xiàn)是表皮朗格漢斯細(xì)胞黏附于淋巴細(xì)胞，值得注意的是此種細(xì)胞間接觸在活動(dòng)性的白癜風(fēng)皮損中也被報(bào)道過(guò)，此可能與色素脫失的過(guò)程有相關(guān)性；而色素沉著區(qū)域的黑素細(xì)胞擁有更多的樹突和大量的IV期黑素小體[11]。但不能解釋為何皮損總是多發(fā)在面部和肢端的背側(cè)，需要更多地研究去探索。

本研究發(fā)現(xiàn)的1個(gè)新的新生突變位于2號(hào)外顯子區(qū)域，造成提前形成終止密碼子，導(dǎo)致其后大片氨基酸缺失，從而引起RNA腺苷酸脫氨酶功能的障礙，導(dǎo)致本病的發(fā)生。我們報(bào)告的c．1162G>T(P．E388X)無(wú)義突變，經(jīng)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)為未報(bào)道過(guò)的新突變。此次研究所發(fā)現(xiàn)的1個(gè)新的無(wú)義突變擴(kuò)大了本病的基因譜，可能對(duì)DSH的致病機(jī)制及治療研究提供新的視野。

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