伊曲康唑抑制小鼠樹突狀細胞遷移及MMP-2、MMP-3、MMP-12與RANTES的分泌

鄭曉麗 梁官釗 史冬梅 沈永年 劉維達 陳官芝

伊曲康唑(itraconazole, ITZ)屬三唑類抗真菌藥，在臨床真菌病治療中廣泛應用。近年研究顯示，伊曲康唑存在免疫調節作用，對掌跖膿皰病、扁平苔蘚及特應性皮炎等皮膚病存在治療作用[1-4]，機制尚不清楚。樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是目前已知功能最強的抗原提呈細胞，在免疫應答啟動、進展及免疫調控過程中發揮關鍵作用。DCs參與炎癥反應，與趨化因子RANTES等[5]和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)等[6]表達密切相關，并在腫瘤、感染及皮膚病等病程中扮演重要角色。MMPs能降解細胞外基質蛋白，包括MMP-1～MMP-19，其中MMP-2屬于明膠酶類，MMP-3屬于基質分解素類，MMP-12屬于其他未分類。筆者發現，伊曲康唑可以抑制小鼠DCs RANTES表達和MMP-2、MMP-3和MMP-12分泌，顯示伊曲康唑具有免疫調節作用。

1 材料和方法

1.1 材料、藥物及儀器 細胞樹突狀細胞為小鼠骨髓來源單核細胞定向誘導所得。伊曲康唑、脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)和二甲基亞砜購于美國Sigma公司。重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant murine granulocyte-macrophage colony stimulating factor, rmGM-CSF)購于美國Peprotech公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和RPMI1640購于美國Gibco公司，(Sigma，USA)； 細胞計數試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)購于上海Yeasen公司；熒光標記抗鼠單克隆抗體CD11c、MHCII、CD40、CD80、CD86、CCR7購于美國eBiosciences公司。Luminex所用試劑盒由BD PharMingen公司提供。所有加伊曲康唑的試驗均選用無脂血清進行試驗。

1.2 DCs的獲取 C57小鼠頸椎脫臼處死，置于75%酒精浸泡3分鐘后取出。無菌取出股骨和脛骨，PBS洗滌兩次，抽取骨髓，收入15 mL離心管中；1200 rpm離心5 min,棄上清，收集沉淀的骨髓細胞；然后，細胞以2×106個細胞的密度接種于100 mm細菌培養皿，培養皿中含10 mL含10%胎牛血清和20 ng/mL rmGM-CSF的RPMI 1640培養基。在第2天，將10 mL將含20 ng/mL rmGM-CSF RPMI 1640完全培養基加入板中。在第4、6天，收集一半的培養上清液分別離心。細胞沉淀物重新懸浮在10 mL含20 ng/mL rmGM-CSF的新鮮RPMI 1640培養基中，并倒回原板。在第8天，收獲DCs用于后面的實驗。

1.3 細胞毒性試驗 收集培養至第8天的DCs，以每孔2×104個細胞接種于96孔培養板，每孔200 μL RPMI 1640(含10%無脂血清、20 ng/mL rmGM-CSF、1 μg/mL LPS及不同濃度伊曲康唑)，伊曲康唑使用濃度為0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μM，處理細胞12、24、48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，37℃、5% CO2培養3 h后用酶標儀在450 nm處測吸光度(A)值，每組5個復孔，設置空白對照，實驗重復三次。細胞存活率=(處理組細胞A 值-空白組A值)/(正常對照組細胞A -空白組A值)×100%。

1.4 Transwell檢測DCs的遷移 取培養至第8天的DCs，用含10%無脂血清、20 ng/mL的rmGM-CSF、1 μg/mL的LPS的RPMI 1640調整細胞濃度至1×106cells/mL，上室加200 μL細胞，下室加500 μL含上述成分的培養基。并分別在上下室加入伊曲康唑，調整其濃度為0.25、0.5和1 μM。4 h 后取出上室，將上室內面用棉簽擦凈，用95%甲醇固定上室細胞，收下室細胞流式細胞儀計數。上室細胞固定后結晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Luminex液相芯片技術檢測細胞因子 收集培養至第8天的DCs，以每孔1×106的密度接種于12孔板，每孔含1 mL RPMI 1640培養基(含10%無脂血清、20 ng/mL rmGM-CSF、1 μg/mL LPS及0.25、0.5或1 μM伊曲康唑)，同時設立對照組，培養12 h后，分別收集上述培養細胞上清；采用Luminex液相芯片技術檢測上清液中MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-12和RANTES的水平，嚴格按照其操作流程進行檢測。

1.6 流式細胞術檢測DCs表面分子及CCR7的表達 收集上述處理的各組DCs，制備細胞懸液(1×106cells/mL)，流式染色液洗2遍，用100 μL流式染色液重懸后，在Falcon管中加入熒光素標記的CD11c、MHCII、CD40、CD80、CD86 及CCR7單克隆抗體，混勻后室溫避光孵育30 min，流式染色液洗滌2次，流式細胞儀分析。同時設陰性對照管。

2 結果

2.1 小鼠骨髓單核細胞在體外分化為樹突狀細胞 小鼠骨髓單核細胞，在rmGM-CSF的誘導下，經過8天的培養和LPS的誘導，細胞體積增大，細胞呈半懸浮生長，表面有樹枝狀突起(見圖1a)。培養至第8天的DCs， CD11c 表達量高(圖1b)，說明骨髓來源單核細胞大部分已經誘導分化為DCs。

圖1 a:培養至第8天的樹突狀細胞表面有樹枝狀突起(200×)；b:流式細胞儀檢測細胞表面CD11c的表達

2.2 伊曲康唑對DCs活力的影響 CCK-8 法檢測DCs生長抑制率，結果顯示在高濃度時伊曲康唑能明顯抑制DCs的生長(P<0.05)，伊曲康唑對DCs的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性，但在濃度<2 μM)時，其對細胞的抑制率增強不明顯，見圖2。 然而當伊曲康唑濃度大于2 μM時，在孵育12 h后，伊曲康唑即對DCs顯示出明顯抑制作用。為了排除因細胞活力受影響造成的陽性結果，我們選用了安全范圍之內的0.25、0.5和1 μM相互作用12 h用于后續實驗。1 μM 12 h時細胞存活率為(92.33±13.80)%，與對照組相比，細胞活力無明顯差異。而我們使用的最高濃度1 μM與臨床用量200 mg，一日兩次所達到的血藥濃度值相當。

2.3 Transwell檢測伊曲康唑抑制了DCs的遷移 如圖3a所示，流式細胞儀計數顯示伊曲康唑抑制了DCs的遷移。倒置顯微鏡下拍照亦顯示隨著伊曲康唑濃度的升高，遷移的細胞數減少(圖3b)。與對照組相比，伊曲康唑濃度為0.5 μM時，遷移到下室的細胞比例為(1.44±0.16)%，濃度為1 μM時，遷移到下室的細胞比例為(1.42±0.13)%，與對照組(1.85±0.13)%相比，差異有顯著意義(圖4,P<0.05)。

圖2 伊曲康唑對樹突狀細胞活力的影響

圖3 伊曲康唑對樹突狀細胞遷移的影響 a:流式細胞儀檢測下室遷移的細胞數;b:倒置顯微鏡下拍照上室外側面遷移的細胞數(100×)

圖4 流式細胞儀計數遷移細胞數百分比統計圖表(*P<0.05)

2.4 伊曲康唑抑制了MMP-2、MMP-3、MMP-12和RANTES 的分泌，對MMP-8 的分泌無明顯影響 如圖5所示，在伊曲康唑濃度為0.25 μM時，MMP-2的分泌量為(351.89±8.54)pg/mL；濃度為0.5 μM時，為(340.415±24.77)pg/mL；濃度為1 μM時，為(325.6±6.49) pg/mL，對照組為(400.20±4.86)pg/mL，均P<0.05。對MMP-3的分泌，當在伊曲康唑濃度為0.25 μM時，MMP-3的分泌量為(112.135±10.975)pg/mL；濃度為0.5 μM時，為(110.23±10.79)pg/mL；濃度為1 μM時，為(90.49±0.63)pg/mL,對照組為(161.9525±13.2575) pg/mL，均P<0.05。對MMP-12的分泌，當在伊曲康唑濃度為0.25 μM時，MMP-12的分泌量為(12712±19.80)pg/mL；濃度為0.5 μM時，為(12903±250.32)pg/mL；濃度為1 μM時，為(12512.5±311.83)pg/mL，對照組為(13695.5±147.79)pg/mL，均P<0.05。

對RANTES的分泌，當在伊曲康唑濃度為0.25 μM時，RANTES的分泌量為(888.49±77.53)pg/mL；濃度為0.5 μM時，為(937.34±74.16)pg/mL；濃度為1 μM時，為(794.58±33.38)pg/mL,對照組為(1120.5±55.11)pg/mL，均P<0.05。

圖5 伊曲康唑對MMP2、MMP3、MMP12、RANTES、MMP8分泌的影響(*P<0.05，**P<0.01)

2.5 伊曲康唑對DCs表面分子和CCR7的表達的影響 伊曲康唑處理組與對照組間CD11c、MHCII、CD40、CD80、CD86的表達未見顯著差異(P>0.05，數據未示)。對CCR7的表達，如圖6所示，當伊曲康唑濃度為1 μM時，CCR7的表達量為(16.77±5.35)%，濃度為0.5 μM時，CCR7的表達量為(14.2±2.52)%，與對照組(14.4±3.73)%相比，差異均無顯著意義。

圖6 伊曲康唑對樹突狀細胞CCR7表達的影響(P>0.05)

3 討論

DCs是體內功能最強大的抗原提呈細胞，它能夠顯著刺激初始T細胞增殖。未成熟DCs進入外周組織后具有較強的抗原攝取和處理功能，成熟的DCs具有較強的抗原提呈功能并調節Th1/Th2平衡，與感染和免疫性疾病(銀屑病等)的發生、發展、治療和轉歸密切相關[7]。

RANTES是CC型趨化因子，可由血小板和樹突狀細胞等分泌，主要作用于T淋巴細胞，使其趨化至皮膚中并將其活化，其還可趨化嗜酸粒細胞、人單核細胞等[8]。RANTES在銀屑病和特應性等慢性炎癥性疾病發生發展及過敏性疾病中扮演重要角色，銀屑病患者皮損處RANTES較非皮損區及正常皮膚高，其可引起皮損T淋巴細胞活化及聚集[9]。David等研究發現銀屑病患者治療后外周血RANTES水平較對照組明顯降低。并且，特應性皮炎患者皮膚中RANTES表達升高[10]。

MMPs能夠降解細胞外基質、參與新生血管形成、調節細胞黏附、激活潛在活性蛋白。MMP-2、MMP-3和MMP-12參與基質主要成分IV型膠原的降解，對血管生成及細胞微環境調節具有重要意義[11，12]。國內研究顯示，尋常型銀屑病患者治療后，血清中MMP-2水平降低[13-15]。Glazewska等[16]發現NB-UVB治療銀屑病，癥狀緩解后血清MMP-2水平隨之降低。Sawa等[17]應用MMP-2抑制劑治療銀屑病有較好療效, 說明MMP-2是抗銀屑病藥的藥物靶位之一。 MMP-3破壞基底膜及血管壁的完整性使炎性細胞得以進入表皮，后者再與角質形成細胞相互作用，促發了其他的病理改變，這可能在銀屑病的發病早期起著一定的作用[18，19]。MMP-12可由巨噬細胞和樹突狀細胞分泌，在MMP-2和MMP-3的激活過程中起重要作用[20]，與銀屑病皮損真皮乳頭層免疫細胞的浸潤相關[21]，且皮損部位MMP-12 mRNA表達水平顯著高于非皮損部位[22]。本研究發現，伊曲康唑顯著抑制了樹突狀細胞MMP-2、MMP-3和MMP-12的表達，這可能揭示了其部分免疫調節機制。

伊曲康唑抑制小鼠樹突狀細胞的遷移和MMP-2、MMP-3、MMP-12及RANTES的表達，可能為其免疫調控作用機制之一。然而，我們另有實驗發現伊曲康唑可以增強巨噬細胞對白念珠菌的吞噬作用及抗感染免疫能力。我們初步認為，伊曲康唑的免疫調節作用存在疾病特異性，即在不同性質免疫細胞主導的疾病中其發揮的作用可能有差異，然而更深入的機制尚待探討。

[1] V’Lckova-Laskoska MT, Caca-Biljanovska NG, Laskoski DS, et al. Palmoplantar pustulosis treated with itraconazole: a single, active-arm pilot study[J]. Dermatol Ther,2009,22(1):85-89.

[2] Libow LF, Coots NV. Treatment of lichen planus and lichen nitidus with itraconazole: reports of six cases[J]. Cutis,1998,62(5):247-248.

[3] Abbas Z, Ghodsi SZ, Abedeni R. Effect of itraconazole on the quality of life in patients with moderate to severe seborrheic dermatitis: a randomized, placebo-controlled trial[J]. Dermatol Prac Concept,2016,6(3):11-16.

[4] Brouwers KJ, Vis R, Tupker RA. Itraconazole as a continuous treatment for atopic dermatitis? A case report[J]. J Eur Acad Dermatol Venereol,2016,30(5):873-874.

[5] Verzura J, Ponce L, Pernia M, et al. Effect of leishmania mexicana, Rantes and TNF alpha on splenic dendritic cells of newborn and adult BALB/c mice: phenotypic characteristics and migratory properties[J]. Invest Clin,2012,53(3):237-249.

[6] Hubel J, Hieronymus T. HGF/Met-Signaling contributes to immune regulation by modulating tolerogenic and motogenic properties of dendritic cells[J]. Biomedicines,2015,3(1):138-148.

[7] Qian C, Cao X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation[J]. Semin Immunol,2018,35:3-11.

[8] Zhu K, Shen Q, Ulrich M, et al. Human monocyte-derived dendritic cells expressing both chemotactic cytokines IL-8, MCP-1, RANTES and their receptors, and their selective migration to these chemokines[J]. Chin Med J,2000,113(12):1124-1128.

[9] 唐玲，李泉，陳潔，等. RANTES在銀屑病患者角質形成細胞中的表達及其作用[J]. 中國麻風皮膚病雜志,2003,19(5):426-427.

[10] Giustizieri ML, Mascia F, Frezzolini A, et al. Keratinocytes from patients with atopic dermatitis and psoriasis show a distinct chemokine production profile in response to T cell-derived cytokines[J]. J Allergy Clin Immunol,2001,107(5):871-877.

[11] Mezentsev A, Nikolaev A, Bruskin S. Matrix metalloproteinases and their role in psoriasis[J]. Gene,2014,540(1):1-10.

[12] Stanciute D, Didziapetriene J, Kadziauskas J. Expression of matrix metalloproteinases in patients with malignant tumors[J]. Medicina (Kaunas),2004,40(12):1143-1150.

[13] 裘宇光. 銀屑病患者基質金屬蛋白酶-2與基質金屬蛋白酶-9的檢測價值[J]. 浙江中西醫結合雜志,2010,20(11):671-672.

[14] 肖嶸，嚴開林，黃晉華，等. 基質金屬蛋白酶在銀屑病患者皮損中的表達[J]. 中華皮膚科雜志,2004,37(10):611-612.

[15] 何秋波，李紅文，于建斌. 銀屑病患者皮損中血管內皮生長因子和基質金屬蛋白酶2的表達[J]. 中華皮膚科雜志,2004,37(7): 398-399.

[16] Glazewska EK, Niczyporuk M, Lawicki S, et al. Therapy of psoriasis with narrowband ultraviolet-B light influences plasma concentrations of MMP-2 and TIMP-2 in patients[J]. Ther Clin Risk Manag,2016,12:1579-1585.

[17] Sawa M, Tsukam oto T, k iyoi T, et al. New strategy for antedrug application: development of metalloproteinase inhibitors as antipsoriatic drugs[J]. J Med Chem,2002,45 (4):930 -936.

[18] McCawley LJ, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: they’re not just for matrix anymore![J]. Curr Opin Cell Biol,2001,13(5):534-540.

[19] Chandran V, Cook RJ, Edwin J, et al. Soluble biomarkers differentiate patients with psoriatic arthritis from those with psoriasis without arthritis[J]. Rheumatology, 2010,49(7):1399-1405.

[20] Matsumoto S, Kobayashi T, Katoh M, et al. Expression and localization of matrix metalloproteinase-12 in the aorta of cholesterol-fed rabbits: relationship to lesion development[J]. Am J Pathol,1998,153(1):109-119.

[21] Suomela S, Kariniemi AL, Snellman E, et al. Metalloelastase (MMP-12) and 92-kDa gelatinase (MMP-9) as well as their inhibitors, TIMP-1 and -3, are expressed in psoriatic lesions[J]. Exp Dermatol,2001,10(3):175-183.

[22] Starodubtseva NL, Sobolev VV, Soboleva AG, et al. Expression of genes for metalloproteinases (MMP-1, MMP-2, MMP-9, and MMP-12) associated with psoriasis[J]. Genetika,2011,47(9):1254-1261.