普通小麥 TaCAT 9基因的克隆與表達分析

褚瑩瑩,王晨陽,2，陳雨露，康 娟，馬 耕，劉衛星,胡陽陽，李莎莎

(1.河南農業大學農學院，河南鄭州 450002； 2.國家小麥工程技術研究中心，河南鄭州 450002)

氨基酸是植物體內氮素存在的主要形式，能夠作為含氮通貨參與到各種代謝途徑中，而這個過程有賴于氨基酸轉運蛋白的運輸功能，因此研究氨基酸轉運蛋白的功能對于植物氮代謝的研究具有重要意義[1-2]。植物中的氨基酸轉運蛋白可分為五大超家族，但研究較多的主要有兩個超家族：一個是氨基酸轉運蛋白超家族(ATFs)，約有46個成員，至少又可分為5個亞家族；另一個是氨基酸-多胺-膽堿轉運蛋白超家族(APCs)，有14個成員,又分為L型氨基酸轉運蛋白(LATs)和陽離子氨基酸轉運蛋白(CATs)兩個亞家族[3-5]。研究表明，除了脯氨酸轉運蛋白，所有的氨基酸轉運蛋白都表現出顯著的底物專一性[6]。許多研究證明氨基酸轉運蛋白的表達具有組織及器官特異性，且受多種因素的影響，如光、線蟲感染、蔗糖、滲透勢、銨鹽、硝酸鹽及谷氨酸等[7-9]。目前對ATFs超家族的研究較為透徹，而對APCs超家族的研究相對較少，本試驗的研究對象CAT9是CATs亞家族中的一員[9]。

對植物CATs亞家族的研究報道主要集中在模式植物中，擬南芥CATs亞家族有9個成員，大都定位于質膜或液泡膜上，具有11～14個推測的跨膜結構域[9-10]。AtCAT1啟動子與GUS融合表達分析顯示，該基因主要高表達于衰老的葉片，在初生根的根尖及花中也能檢測到少量表達，猜測該基因可能參與氨基酸向種子的運輸[11]。AtCAT2主要定位于液泡膜,可能通過參與氨基酸的跨液泡膜轉運來調節葉片可溶性氨基酸濃度；AtCAT3和AtCAT4分別定位于高爾基體膜和液泡膜，具體功能有待研究[12]。AtCAT5主要在籽粒中表達，可能在籽粒形成或種子萌發過程中裝載種柄中的氨基酸，又有研究表明該基因在真葉邊緣部位的表達量也比較高，可能參與重新吸收葉緣部位滲漏的氨基酸[13-14]。AtCAT6只在根原基、花及種子等作為庫的組織器官中表達，而且在根部的表達水平能夠受到根結線蟲感染的誘導[9]。AtCAT7在正常環境下的表達水平非常的低[13]，AtCAT8在根和植株上部的分生組織中有較高的表達豐度，其功能可能是介導氨基酸特別是谷氨酸和谷氨酰胺向植株幼嫩分生組織分配[14]。研究表明，擬南芥中AtCAT9基因主要定位于囊泡膜上，具有比較廣泛的表達特性，在大多數組織器官中都有表達，可能參與調控液泡內外氨基酸濃度的平衡，過表達AtCAT9的擬南芥植株在低氮脅迫下具有生長發育延遲、葉片衰老緩慢的現象[15]。番茄中的研究表明，CAT9可能充當膜兩側GLU/ASP與GABA之間交換的媒介，導致番茄成熟過程中大液泡內GLU/ASP增加，GABA減少，從而影響番茄的口感與營養品質[16]。

小麥是全球最重要的糧食作物之一，其產量高低直接關系著世界糧食安全。研究氮代謝相關基因的功能對提高氮素利用率及產量具有重要意義。本實驗室通過前期的蛋白組學研究發現小麥幼苗葉片中的TaCAT9蛋白參與低氮脅迫的應答，說明其可能在氮素脅迫條件下起著某種調控作用(數據未發表)。通過查閱文獻發現，目前有關小麥TaCAT9基因及CATs基因家族的研究尚未見報道。鑒于此，本研究采用同源克隆的方法，從普通小麥品種豫麥49-198中克隆TaCAT9兩個部分同源基因的cDNA序列，對其進行生物信息學分析，同時研究了TaCAT9在不同組織器官中及氮素脅迫下的表達特性，以期為進一步探索TaCAT9的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試材料為河南省大面積種植的小麥品種豫麥49-198，該品種具有豐產、優質、抗逆性好的特點,由河南平安種業有限公司惠贈。

選取籽粒飽滿的豫麥49-198種子，經75%酒精浸泡10 min后,用蒸餾水清洗干凈，置于干凈的濕毛巾上，在黑暗條件下放置48 h，期間保持毛巾濕潤狀態。待種子露白后，選取發芽一致的種子置于滅菌培養皿中，在光暗周期16/8 h、光照強度250 μmol·m-2·s-1、晝夜溫度25/15 ℃、晝夜相對濕度60%和70%的培養箱中培養。培養液為Hoagland全營養液，每天更換一次。待幼苗長至兩葉一心，將幼苗做兩種處理：一種為對照組，在Hoagland全營養液中生長；另一種為處理組，生長于缺氮的Hoagland營養液(用KCl和CaCl2代替Hoagland營養液中的KNO3和Ca(NO3)2)中。分別在0、0.25、0.5、1和7 d時取對照組與處理組的小麥幼苗葉片用于低氮脅迫下目的基因的表達模式分析。剪取正常處理兩葉一心期的葉片用于目的基因的克隆。所有材料用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

目的基因組織特異性表達分析：于2016年10月將豫麥49-198種植于河南農業大學科教園區試驗田，正常水肥管理，即施純氮240 kg·hm-2、磷肥(P2O5)150 kg·hm-2、鉀肥(K2O)120 kg·hm-2，分別于拔節期和揚花期灌水，水表計量，每次灌水量750 m3·hm-2。小區面積為21 m2(7 m×3 m)。由于從2010年起，連續六年對該小區采取了精細化的栽培管理措施，因此土壤養分等條件基本一致。在小麥開花期選取花期與長勢一致的植株掛牌標記，于花后15 d取標記植株的根、莖、葉和籽粒，液氮速凍后保存于-80 ℃ 冰箱備用。

1.2 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

小麥根、莖、葉和籽粒總RNA的提取采用Trizol法，具體提取步驟參照Trizol Reagent(北京索萊寶科技有限公司)說明書進行。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取總RNA的完整性，并采用ND-1000微量紫外分光光度計(基因有限公司)測定RNA的濃度和純度。總RNA經DNaseⅠ(普洛麥格(北京)生物技術有限公司)處理后作為模板，參照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(寶生物工程(大連)有限公司)合成cDNA第一條鏈，-20 ℃保存備用。

1.3 引物設計及TaCAT9基因的克隆

以二穗短柄草CAT9(XM_003569968.3)的cDNA序列為探針在Ensembl Plants六倍體小麥數據庫(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)進行比對，得到三條高度相似且分別定位在6 A、6 B和6 D長臂上的序列，對應的序列號分別為TRIAE_CS42_6AL_TGACv1_471594_AA1511590.1，RIAE_CS42_6BL_TGACv1_501182_AA1614650.1和TRIAE_CS42_6DL_TGACv1_526398_AA1682300.1；長度分別為2 462、2 572和2 365 bp，均包含一個長度為1 818 bp的開放閱讀框。比對這三條序列開放閱讀框的上下游，利用Primer5.0軟件在三條序列相似的部位設計兩對引物TaCAT9-F-1/TaCAT9-R和TaCAT9-F-2/TaCAT9-R用于三個部分同源基因cDNA序列的擴增。由于上游引物5′端第五個堿基在三條序列的結合位點上存在一個由T到C的替換，所以設計兩條上游引物TaCAT9-F-1和TaCAT9-F-2，它們只在的5′端第五個堿基存在差異，分別為T和C。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，序列信息見表1。以豫麥49-198兩葉一心時期葉片的cDNA為模板進行PCR擴增，所用的酶為2×Phanta Max Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)。擴增體系與程序參照說明書，其中循環數為32，退火溫度為56 ℃，延伸時間為2 min 30 s。擴增結束后，用1%的瓊脂糖對PCR產物進行電泳檢測，回收純化目的片段后，將目的片段連接至克隆載體pTOPO-Blunt simple(北京愛德萊生物科技有限公司)，轉化大腸桿菌感受態細胞DH10B(北京中美泰和生物技術有限公司)，從兩對引物組合的擴增產物中挑選經PCR鑒定正確的陽性克隆送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行測序。

1.4 TaCAT9基因編碼蛋白的生物信息學分析

運用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對TaCAT9基因編碼蛋白的理化性質進行預測；運用WOLF PSORT(https:// psort.hgc.jp/)和TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對編碼蛋白的信號肽、亞細胞定位及跨膜區進行預測；運用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)對編碼蛋白保守結構域進行預測。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預測TaCAT9蛋白質的二級結構，用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/Phyre2/html/page.cgi?id=index)預測蛋白質的三級結構。以TaCAT9蛋白序列為探針，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索不同物種的同源蛋白，并利用DNAMAN5.2.2進行蛋白序列的多重比對，利用MEGA5.0構建基于neigbor-joining(bootstrap值為1 000)的系統發育樹。

1.5 TaCAT9基因的表達分析

由于序列高度相似，未能設計出分別針對TaCAT9-A和TaCAT9-B的特異引物，只設計了一對針對兩序列的特異性引物。利用NCBI在線引物設計工具primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)在TaCAT9-A和TaCAT9-B序列的保守區(避開核苷酸突變點)設計引物對TaCAT9-qPCR-F/TaCAT9-qPCR-R(表1)，用于檢測TaCAT9基因的相對表達量；內參基因采用小麥看家基因β-Actin(AB181991)，所用引物Actin-F/Actin-R序列見表1[17]。qRT-PCR體系與程序參照SYBR Premix ExTaqTMⅡ(寶生物工程(大連)有限公司)說明書，其中循環數為40，退火溫度為60 ℃，延伸時間為30 s。所用反應平臺為CFX Connect Real-time Systerm(伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)，每個樣品設置3次生物學重復。目的基因相對表達量的計算采用2-△△CT法，用SPSS 19.0對數據進行顯著性分析，用Excel 2003作圖。

表1 本研究中所用引物的基本信息Table 1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 小麥TaCAT9基因克隆結果

利用引物TaCAT9-F1/TaCAT9-R和TaCAT9-F2/TaCAT9-R分別對豫麥49-198的cDNA進行擴增，分別得到兩條大小約為2 000 bp的特異性條帶(圖1)。將目的條帶回收純化后，經連接、轉化，各篩選30個陽性克隆進行測序。測序結果與中國春的三條序列(見材料方法)進行比對，結果表明：TaCAT9-F1/TaCAT9-R擴增產物連接轉化的30個陽性單克隆的序列信息都與TRIAE_CS42_6AL_TGACv1_471594_AA1511590.1相同，而TaCAT9-F2/ TaCAT9-R有3個單克隆的序列與TRIAE_CS42_6BL_TGACv1_501182_AA1614650.1相同，其余都與TRIAE_CS42_6AL_TGACv1_471594_AA1511590.1相同。所以本試驗共得到兩個TaCAT9基因的cDNA序列，因其分別位于小麥A和B亞基因組上，故將其分別命名為TaCAT9-A和TaCAT9-B。對于TaCAT9-D，可能由于表達量過低或者沒有表達，本研究沒能克隆到其cDNA序列。通過比對分析發現，兩序列間存在28個單核苷酸突變位點，其中8個為有義突變，導致7個氨基酸的改變，分別為第116、136、154、652、1 420、1 546、1 547和1 711位堿基，其中第1 546位與第1 547位共同導致一個氨基酸的改變；其余20個為沉默突變 ，沒有導致氨基酸的變化(圖2)。

1：引物TaCAT9-F1/TaCAT9-R 的擴增產物；2：引物TaCAT9-F2/TaCAT9-R 的擴增產物；M：Trans2k Plus DNA marker。

1:Amplified products of primer TaCAT9-F1/TaCAT9-R；2:Amplified products of primer TaCAT9-F2/TaCAT9-R；M：Trans2k Plus DNA marker.

圖1TaCAT9基因的RT-PCR擴增產物

Fig.1AmplifiedproductsofTaCAT9genebyRT-PCR

圖2 TaCAT9-A和TaCAT9-B的cDNA序列比對Fig.2 Alignment of cDNA sequences between TaCAT9-A and TaCAT9-B

2.2 TaCAT9基因編碼蛋白的生物信息學分析

2.2.1TaCAT9基因編碼蛋白的理化性質

由于序列相似度極高，protparam在線預測分析顯示TaCAT9-A和TaCAT9-B兩蛋白基本理化性質非常接近，分子式分別為C2959H4619N743O802S19和C2962H4626N746O799S19，分子量分別為64.04和64.08 kDa，理論等電點(pI)分別為8.23和8.27，屬于弱堿性蛋白。脂肪族氨基酸指數分別為114.91和114.76，負電荷的氨基酸殘基數(Asp+Glu)分別為31和30；正電荷的氨基酸殘基數(Arg+Lys)分別為34和35。總平均親水性值(GRAVY)分別為0.745和0.739，不穩定系數分別為35.62和35.68，兩者都屬于疏水穩定蛋白。

2.2.2TaCAT9基因編碼蛋白的亞細胞定位、跨膜區及保守結構域

WOLF PSORT預測分析顯示，兩蛋白均定位于細胞膜上，沒有分泌通路信號肽，即兩蛋白都不屬于分泌型蛋白。TMHMM在線預測表明TaCAT9-A和TaCAT9-B蛋白都存在13個跨膜區，屬于膜蛋白，這和前人對CAT亞家族蛋白跨膜區的描述相吻合。InterProScan保守結構域分析顯示(圖3)，兩蛋白都屬于氨基酸透性酶家族，且都含有一個典型的陽離子氨基酸轉運蛋白的保守C末端。

2.2.3TaCAT9基因編碼蛋白的氨基酸序列比對及進化分析

利用DNAMAN將TaCAT9-A和TaCAT9-B蛋白的氨基酸序列與來自玉米(NP_001168279.1)、水稻(XP_015627412.1)和高粱(XP_002454544.1)的CAT9氨基酸序列進行多重比對。結果(圖4)表明，4個物種間的CAT9蛋白氨基酸序列長度差別不大，都約有600個氨基酸，且同源性較高。TaCAT9-A和TaCAT9-B兩者的同源性達到98.84%，4個物種間的同源性達到91.26% ，氨基酸序列高度保守，都包含13個跨膜區和1個保守的陽離子氨基酸轉運蛋白的C末端。

圖3 TaCAT9-A和TaCAT9-B蛋白的保守結構域分析Fig.3 Conserved domains of TaCAT9-A protein and TaCAT9-B protein

方框指示陽離子氨基酸轉運蛋白的C末端，橫線指示13個跨膜區。

The box indicates the C-terminal of cationic amino acid transporter and the horizontal lines indicate 13 transmembrane regions.

圖4TaCAT9與其他物種同源蛋白的多序列比對

Fig.4Multi-alignmentofTaCAT9aminoacidsequencewithotherCAT9s

進化分析(圖5)表明，所有參比的CAT9蛋白可以被分為兩大類，小麥等單子葉植物為一類，擬南芥等雙子葉植物為一類。其中與TaCAT9-A蛋白親緣關系最近的為烏拉爾圖小麥的CAT9蛋白，而山羊草CAT9蛋白與前二者聚類在一起，TaCAT9-B蛋白與上述三者聚類在一起。

圖5 小麥與其他物種CAT9蛋白的進化分析Fig.5 Phylogene tree of CAT9 proteins from wheat and other species表2 TaCAT9蛋白的二級結構預測及所占比例Table 2 Prediction proportion of secondary structure of TaCAT9 protein %

2.2.4TaCAT9基因編碼蛋白的二級及三級結構預測結果

通過SOPMA在線預測分析了TaCAT9-A和TACAT9-B的二級結構組成(表2)，兩者都是由α-螺旋、延伸直鏈、β-轉角和無規則卷曲四種二級結構組成，兩個蛋白所含的各種二級結構比例相近，其中α-螺旋所占比例最高，無規則卷曲次之。通過Phyre 2構建了蛋白的3D模型，因TaCAT9-A 與TACAT9-B氨基酸序列高度相似，所以同源建模選用的蛋白模型相同，3D結構圖也相同。該模型中有73%的氨基酸序列結構預測置信度達到100%，因此該蛋白質結構模型可信度較高。由圖6可知，兩蛋白主要由13個α-螺旋組成，這與TMHMM預測的兩個蛋白都有13個跨膜區一致。

2.3 TaCAT9基因的表達特性分析

在根、莖、葉和籽粒中均可檢測到TaCAT9基因的表達，但在根和籽粒中的表達量最低，莖中次之，葉片中的表達量最高，推測TaCAT9基因主要在葉片中表達(圖7)。進一步的分析顯示，在氮脅迫下，小麥葉片TaCAT9基因的表達呈上升趨勢，在脅迫初期變化不明顯，隨著脅迫時間的增加表達量逐漸上調。

圖6 TaCAT9蛋白的三級結構預測Fig.6 Prediction of three dimensional structure of TaCAT9 protein

圖柱上的小寫字母不同表示在0.05水平差異顯著。

The different lower-case letters above the bar indicate significant difference at 0.05 level.

圖7TaCAT9基因的組織器官表達模式(A)和氮脅迫下TaCAT9基因在葉片中的表達模式(B)

Fig.7ExpressionpatternsofTaCAT9indifferenttissuesofwheatandexpressionpatternsofTaCAT9geneinleavesundernitrogenstress

3 討 論

普通小麥是一個典型的異源六倍體物種，由三個序列高度同源的亞基因組A、B和D組成[18]。因此，小麥中大部分基因在A、B和D三個亞基因組上都有一個基因位點，這三個基因稱為部分同源基因。研究表明，在六倍體小麥的產生以及進化過程中，部分同源基因的表達可能產生分化[1,19]。如小麥膨脹素基因(TaEXPA1)，它的三個部分同源基因TaEXPA1-A/B/D在幼苗的根中都是沉默的，但TaEXPA1-A和TaEXPA1-D在幼葉中表達，而TaEXPA1-B在該組織中則是沉默的[20]。小麥TaWLHSI-A/B/D在不同的組織器官中具有不同的表達模式：TaWLHSI-B幾乎在所有組織器官中的表達量都低于另外兩個基因，TaWLHSI-A在幼穗中表達量最高，TaWLHSI-D則在稃中高表達[21]。以上研究表明，三個部分同源基因可能通過表達的分化來實現功能的相互協調，從而來調控小麥的生長發育。這一調控網絡的復雜性，大大增加了小麥遺傳和功能分析的難度。在研究小麥的某個基因時，研究者需要面對三個序列高度同源的基因，由于缺乏小麥基因組信息，使得區分部分同源基因的難度會很大，所以很多研究者并沒有對它們加以區分。2014年，IWGSC(國際小麥基因組測序組織)采用先分離染色體臂，再對染色體臂分別測序的方法，發表了基于染色體測序的六倍體小麥中國春的序列草圖，這為研究小麥部分同源基因的遺傳和功能分析提供了一個很好的參考[22]。本研究所用的Ensemble plants網站中的小麥數據庫是基于中國春基因組信息而形成的，其中很多基因的轉錄本信息都是通過分析軟件預測的，而且不同品種間的序列信息也可能有所不同，比如存在SNP位點，存在不同的剪切體，這些都需要實驗加以驗證[23-24]。本研究通過二穗短柄草CAT9基因的 cDNA序列在Ensembl plants小麥數據庫中比對到三條高度同源的轉錄本，分別位于小麥6A、6B和6D染色體上，可以初步判定為TaCAT9的三個部分同源基因。以中國春的這三條轉錄本為參考，設計引物，從豫麥49-198克隆到位于6A和6B上的兩條序列，分別將其命名為TaCAT9-A和TaCAT9-B。比對分析發現克隆的兩條序列與中國春的序列相似性達到100%，猜測該基因序列在不同品種間較為保守。可能由于D基因組上的序列表達量過低或者沒有表達，所以本研究沒有克隆到。另一方面從篩選單克隆測序的結果來看，本研究所采用的組織材料中，A基因組上的序列表達量最高，其他兩種遠遠低于該序列，推測三個部分同源基因中TaCAT9-A基因發揮主要功能。當然不排除在其他組織器官或受到內外因素的刺激后，三個基因的表達量會發生變化，這需要進一步的研究。

本研究從豫麥49-198中克隆到的兩個TaCAT9基因的cDNA序列編碼區長度都為1 818 bp，編碼605個氨基酸，它們所編碼的蛋白無論從基本理化性質還是結構特征上都高度相似。保守結構域分析表明，兩蛋白都有一個陽離子氨基酸轉運蛋白家族的C末端，且都有13個跨膜結構，這都符合模式作物中CATs亞家族的結構特點。由于尚未發現與小麥TaCAT9基因相關的研究報道，因此了解該基因的功能只能通過參考其他物種中已有的報道。擬南芥中的研究表明氨基酸轉運蛋白是個龐大的多基因家族，而CATs作為APCs家族中的一個亞族，主要參與中性氨基酸的運輸[14]。2015年，Christopher等[16]通過定量蛋白組學的方法分析了番茄由綠變紅過程中果肉細胞液泡膜蛋白的變化，發現CAT9蛋白占液泡膜總蛋白的比例由0.02% 升至0.12%，亞細胞定位分析表明該蛋白不僅存在于液泡膜，而且廣泛存在于細胞的各種膜結構中；進一步研究表明，該蛋白可能在番茄果實成熟過程中充當液泡膜內外GLU/ASP與GABA交換的載體。同一年，Yang等[15]在擬南芥中研究發現，在氮素虧缺的生長條件下，AtCAT9缺失會造成植株萎黃失綠，早衰死亡，而過表達AtCAT9則完全相反，植株發育遲緩，存活率升高，葉片的持綠性明顯增強；進一步分析發現相對于AtCAT9缺失植株，轉基因植株葉片的可溶性氨基酸含量顯著降低，這說明過表達AtCAT9有利于提高氮素利用率，緩解氮素缺失造成的不利影響。本研究中，WOLF PSORT預測分析顯示TaCAT9-A和TaCAT9-B均定位于細胞膜，說明TaCAT9為膜蛋白，但軟件預測的結果較為模糊，該蛋白也有可能位于細胞的多種膜結構中，需要進一步的實驗去明確小麥中CAT9的亞細胞定位。另外，采用同源建模的方法構建TaCAT9蛋白的 3D模型時，Phyre2服務器預測該蛋白可能為GLU與GABA的逆向轉運蛋白，這和番茄中的研究結果較為相似，所以猜測GLU與GABA這兩種氨基酸可能為TaCAT9轉運的底物。qRT-PCR結果顯示，TaCAT9基因主要在小麥葉片中表達，莖中次之，根和籽粒中最少；與正常供氮的植株相比，缺氮植株葉片TaCAT9基因在脅迫初期無變化，隨著脅迫時間的延長該基因的表達量顯著上調，說明TaCAT9參與低氮脅迫應答。而脅迫響應表現出一定的滯后可能是因為無機氮不是氨基酸轉運蛋白的直接作用底物，其在根部吸收后，需要同化為氨基酸及經過一系列反應才能影響到氨基酸轉運蛋白的表達，所以缺氮不會立即影響到TaCAT9的表達。

參考文獻：

[1] 盧永恩.水稻谷氨酸合酶基因和胞質異檸檬酸脫氫酶基因的功能研究以及氨基酸轉運蛋白基因家族分析[D].武漢:華中農業大學,2014:31.

LU Y E.Functional analysis of glutamate synthase genes and cytosolic isocitrate dehydrogenase genes and genome-wide analysis of amino acid transporter gene family in rice [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2014:31.

[2] RENTSCH D,SCHMIDT S,TEGEDER M.Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds in plants [J].FebsLetters,2007,581(12):2281.

[3] 馬 清,管 超,夏曾潤,等.高等植物氮素轉運蛋白研究進展[J].蘭州大學學報(自然科學版),2015,51(2):222.

MA Q,GUAN C,XIA Z R,etal.Membrane proteins mediating nitrogen transport in higher plants [J].JournalofLanzhouUniversity(NaturalSciences),2015,51(2):222.

[4] FISCHER W N,ANDR B,RENTSCH D,etal.Plant amino acid transport [J].TrendsinPlantScience,1998,3(5):189.

[5] 宋奇超,曹鳳秋,鞏元勇,等.高等植物氨基酸吸收與轉運及生物學功能的研究進展[J].植物營養與肥料學報,2012,18(6):1509.

SONG Q C,CAO F Q,GONG Y Y,etal.Current research progresses of amino acids uptake transport and their biological roles in higher plants [J].PlantNutritionandFertilizerScience,2012,18(6):1509.

[6] RENTSCH D,HIRNER B,SCHMELZER E,etal.Salt stress-induced proline transporters and salt stress-repressed broad specificity amino acid permeases identified by suppression of a yeast amino acid permease-targeting mutant [J].ThePlantCell,1996,8(8):1437.

[7] OKUMOTO S,KOCH W,TEGEDER M,etal.Root phloem-specific expression of the plasma membrane amino acid proton co-transporter AAP3 [J].JournalofExperimentalBotany,2004,55(406):2155.

[8] HIMER A,LADWIG F,STRANSKY H,etal.ArabidopsisLHT1 is a high-affinity transporter for cellular amino acid uptake in both root epidermis and leaf mesophyll [J].ThePlantCell,2006,18(8):1931.

[9] HAMMES U Z,NIELSEN E,HONAAS L A,etal.AtCAT6,a sink-tissue-localized transporter for essential amino acids inArabidopsis[J].PlantJournal,2006,48(3):415.

[10] WIPF D,LUDEWIG U,TEGEDER M,etal.Conservation of amino acid transporters in fungi,plants and animals [J].TrendsinBiochemicalSciences,2002,27(3):141.

[11] YANG H,POSTEL S,KEMMERLING B,etal.Altered growth and improved resistance ofArabidopsis,against pseudomonas syringae by overexpression of the basic amino acid transporterAtCAT1 [J].PlantCell&Environment,2014,37(6):1404.

[12] YANG H,KREBS M,STIERHOF Y D,etal.Characterization of the putative amino acid transporter genesAtCAT2,3&4:the tonoplast localized AtCAT2 regulates soluble leaf amino acids [J].JournalofPlantPhysiology,2014,171(8):594.

[13] LIU X,BUSH D R.Expression and transcriptional regulation of amino acid transporters in plants [J].AminoAcids,2006,30(2):115.

[14] SU Y H,FROMMER W B,LUDEWIG U.Molecular and functional characterization of a family of amino acid transporters fromArabidopsis[J].PlantPhysiology,2004,136(2):3104.

[15] YANG H,STIERHOF Y D,LUDEWIG U.The putativeCationicAminoAcidTransporter9 is targeted to vesicles and may be involved in plant amino acid homeostasis [J].FrontiersinPlantScience,2015,6:212.

[16] SNOWDEN C J,BENJAMIN T,BAXTER C J,etal.A tonoplast Glu/Asp/GABA exchanger that affects tomato fruit amino acid composition [J].PlantJournal,2015,81(5):651.

[17] 軒紅梅,王永華,魏利婷,等.小麥幼苗葉片中硝酸鹽轉運蛋白NRT1和NRT2家族基因對氮饑餓響應的表達分析[J].麥類作物學報,2014,34(8):1022.

XUAN H M,WANG Y H,WEI L T,etal.Transcription analysis of the genes encoding nitrate transporter NRT1 and NRT2 families in response to nitrogen starvation in wheat seedlings leaves [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,34(8):1022.

[18] MARCUSSEN T,SANDVE S R,HEIER L,etal.Ancient hybridizations among the ancestral genomes of bread wheat [J].Science,2014,345(6194):1250092.

[19] LIU Z L,ADAMS K L.Expression partitioning between genes duplicated by polyploidy under abiotic stress and during organ development [J].CurrentBiology,2007,17(19):1669.

[20] HU Z,HAN Z,SONG N,etal.Epigenetic modification contributes to the expression divergence of threeTaEXPA1 homoeologs in hexaploid wheat(Triticumaestivum) [J].NewPhytologist,2013,197(4):1344．

[21] SHITSUKAWA N,TAHIRA C,KASSAI K,etal.Genetic and epigenetic alteration among three homoeologous genes of a classEMADSbox gene in hexaploid wheat [J].ThePlantCell,2007,19(6):1728.

[22] MAYER K F X,ROGERS J,DOLEEL J,etal.A chromsome-based draft sequence of the hexaploid bread wheat(Triticumaestivum) genome [J].Science,2014,345(6194):1251788.

[23] 韓俊杰,王昊龍,李淼淼,等.小麥淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物學分析[J].麥類作物學報,2015,35(7):908.

HAN J J,WANG H L,LI M M,etal.Cloning and biological analysis of wheatSSⅡagene [J].JournalofTriticeaeCrops,2015,35(7) :908.

[24] 郎丹瑩,呂庚寅,梁廣旺,等.小麥UROS基因的可變剪接[J].麥類作物學報,2016,36(12):1560.

LANG D Y,Lü G Y,LIANG G W,etal,Alternative splicing of uroporphyrinogen Ⅲ synthase genes in wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2016,36(12):1560.