大麥表皮蠟質的組分及晶體結構分析

王 聰，王嘉歡，汪 勇，王中華，權 力

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

植物表皮蠟質是附著在植物最外層的疏水性物質，是植物防止非氣孔性水分散失，抵抗病蟲害入侵，防止昆蟲蠶食，抵抗紫外輻射和霜凍，以及維持植物表皮清潔與植物表面防水的一層保護膜，對植物的生長發育及抗蟲、抗旱等具有重要作用[1-4]。植物表皮蠟質主要由可溶于有機溶劑的超長鏈脂肪族化合物及其衍生物組成[5]。不同物種的蠟質組分及晶體結構均有差異，同一物種不同器官的蠟質組成及晶體結構也不同，有些植物蠟質的晶體結構隨著植物的生長發育而呈現多種形態[6]。前人研究發現，擬南芥、水稻、小麥等表皮蠟質的組分為烷烴、醛、酮、酯、脂肪酸、初級脂肪醇、次級脂肪醇、萜類、酚類、固醇等物質；蠟質的晶體結構呈現片狀、管狀、波浪狀、線狀等多種形態，其中以片狀和管狀居多[7-9]。片狀蠟質的主要組分是伯醇或三萜類化合物，管狀蠟質的主要組分為β-二酮、仲醇和二醇等化合物[10]。在植物生長發育過程中，蠟質的組分和晶體結構與環境條件密切相關，晶體結構會隨蠟質組分的改變而改變[10]。

干旱影響大麥等作物的生理代謝、生長發育、產量及品質[11-15]，植株器官表皮蠟質性狀與作物抗旱性密切相關。但是，有關大麥表皮蠟質組分及晶體結構的研究鮮有報道。本研究以大麥品種Morex為研究對象，采用氣相色譜-質譜聯用儀(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)和掃描電鏡對其不同時期不同器官表皮蠟質組分及其含量、晶體結構進行檢測與分析，以期了解大麥表皮蠟質組成及其晶體形態隨生育進程變化的特點，為大麥葉片、穗下莖及葉鞘表皮蠟質的合成及大麥蠟質合成相關基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與設計

供試材料為大麥Morex，由西北農林科技大學小麥分子生物學與育種實驗室提供。于2016年10月種植大麥于西北農林科技大學北校區西區科研試驗田，翌年分別選取葉片、孕穗期和揚花期穗下莖及葉鞘進行蠟質浸提，并對其進行氣相色譜分析和掃描電鏡分析。

1.2 方 法

1.2.1 樣品制備

分別用鑷子隨機選取大麥種植日后100、130、160、190、210和240 d的頂部葉片作為供試樣品；在大麥孕穗期和揚花期，隨機選取穗下莖和葉鞘作為供試樣品，每種樣品4個重復。用掃描儀分別對樣品進行掃描，用Image J 軟件計算表面積，計算方法：在Image J軟件中打開需要計算面積的葉片，在Set Scale菜單中設定已知距離，選定待測葉片后，待測葉面積被紅色自動填充，在Analyze菜單欄中選擇Analyze Particles計算葉面積，若需計算總面積，可勾選Summarize，輸出結果可粘貼至Excel表中進行處理。

1.2.2 蠟質提取及GC-MS 樣品制備

室溫條件下，在通風櫥內將樣品浸沒在裝有30 mL 氯仿的50 mL 玻璃燒杯中，1 min 后取出(期間用鑷子輕翻葉片使其充分被氯仿浸沒)，加入10 μL C24烷烴(1 mg·mL-1)作為內標，混勻。待氯仿部分揮發后，將剩余溶液過濾至15 mL 樣品瓶中，吸取3 mL 氯仿漂洗燒杯2次并全部過濾至樣品瓶中。待過濾液在通風櫥揮發至1 mL 時，將其轉入GC 樣品瓶中，吸取1 mL 氯仿漂洗過濾液樣品瓶并全部轉入GC 樣品瓶。用氮氣將樣品吹干，加入30 μL 吡啶、30 μL雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺[Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamid]，立即蓋好瓶蓋，70 ℃衍生反應60 min，用氮氣恒溫吹干儀將反應液吹至完全干燥后加入1 mL 氯仿回溶，供GC-MS分析。

1.2.3 蠟質成分分析

采用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS-QP2010，日本島津)測定、分析蠟質成分。

檢測條件：進樣量1 μL，進樣口溫度280 ℃，分流比2∶1，檢測器溫度320 ℃，掃描離子50～600 amu，載氣為氦氣(He2)。升溫程序：50 ℃ 保持2 min；以20 ℃·min-1升溫至240 ℃，保持2 min；以1.5 ℃·min-1升溫至320 ℃，保持15 min。

根據質譜數據庫，對蠟質各組分進行定性分析和鑒定。利用Lab Solution 軟件對各組分離子峰的面積進行積分，參照C24內標定量分析蠟質各組分化合物。

蠟質絕對含量=各組分化合物離子峰面積/內標C24離子峰面積×內標C24體積/樣品體積

相對含量=絕對含量/總含量×100%

1.2.4 掃描電鏡觀察

選擇邊緣平整、形態良好的葉片、穗下莖和葉鞘用回形針固定在白紙上，放置于干燥箱中，待完全干燥后進行掃描電鏡觀察并拍照。

掃描電鏡方法：將完全干燥的樣品取出，用小刀切取2.5 mm×2.5 mm 的正方形放在導電膠上，將導電膠粘貼在托盤上，抽真空后噴金鍍膜(Hitachi,E-1045)，在冷場發射掃描電子顯微鏡(Hitachi,S-4800)中掃描觀察蠟質晶體。

1.3 數據分析

用Excel 2010和DPS 7.05對數據進行統計分析，使用Duncan新復極差法對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 大麥表皮蠟質組分各化合物的碳鏈分布

由GC-MS分析氣相色譜離子峰圖的分布情況可以得出，大麥不同組織表皮蠟質各化合物得到了很好的分離，經質譜數據庫檢索，各組織表皮蠟質化合物種類共鑒別出20種，分別為烷烴、初級醇、脂肪醛、脂肪酸和二酮。其中，烷烴有5種，主要是奇數碳原子，碳鏈長度為C25～C33烷烴；初級醇有5種，主要是偶數碳原子，碳鏈長為C22～C30初級醇；醛有4種，主要是偶數碳原子，碳鏈長為C24～C30；脂肪酸有4種，主要是偶數碳原子，碳鏈長為C22～C28；二酮有2種，分別為碳鏈長為C31的β-二酮和其衍生物羥基-β-二酮。

2.2 大麥不同時期葉片表皮的蠟質組分及含量

對大麥葉片蠟質組分進行定量分析，結果(圖1)表明，大麥葉片表皮蠟質化學組分有初級醇、烷烴、醛、二酮和脂肪酸。初級醇是大麥葉表蠟質的主要成分，以C26醇的含量最高(圖2)。在葉片發育100～190 d期間，大麥葉片蠟質總量持續穩定增加，生長至210 d，葉片蠟質總量呈逐漸降低的趨勢，在240 d時趨于穩定(圖1)。由此可見，大麥葉片蠟質含量隨發育進程推移呈先增加后降低趨勢。由表1可知，在大麥發育100～190 d時，葉片的表皮蠟質組成主要是初級醇(78.25%～85.44%)，其次是烷烴(5.20%～7.48%)、醛(4.15%～6.03 %)、二酮(1.94%～7.88%)和脂肪酸(0.91%～0.97%)；210～240 d時，葉片蠟質主要成分是初級醇(79.39%～80.12%)，其次是二酮(7.77%～9.38%)、烷烴(5.78%～6.66%)、醛(3.87%～4.19%)和脂肪酸(1.58%～1.27%)。由此可見，在大麥不同發育時期，葉片表皮各蠟質組分之間存在差異。發育100～240 d期間，大麥葉片蠟質組分中初級醇的含量先升高后降低。100 d時，由于大麥處于蠟質發育初期階段，蠟質各組分含量均較低。120 d 時，蠟質組分中初級醇含量急劇增加，達到了12.35 μg·cm-2，且處于主導地位，烷烴、醛、脂肪酸和二酮有少量增加。在190 d時初級醇含量達到最大值(14.53 μg·cm-2)，烷烴、醛和脂肪酸的含量也達到頂峰。在發育后期(210～240 d)初級醇的含量持續降低并趨于穩定，烷烴、醛和脂肪酸的含量也在逐漸減少。初級醇的絕對含量在100 d和190 d之間直續增加，但其相對含量卻在190 d時最低；210～240 d時，初級醇的絕對含量和相對含量均較100～160 d有所下降；而二酮的相對含量整體呈增加趨勢，在240 d時最大(9.38%)(圖1，表1)。

圖1 大麥葉片蠟質各組分和總蠟質含量Fig.1 Absolute components and total wax content of barley leaf wax

大麥蠟質中初級醇分別為C22醇、C24醇、C26醇、C28醇和C30醇的偶數碳鏈長度。其中，C26醇是大麥葉片蠟質初級醇的主要成分，在大麥發育的各個時期含量均最高，C24醇、C28醇和C22醇次之，C30醇最少。大麥生長至190 d 時，各碳鏈長度的初級醇含量均達到最高，以C26醇的含量最高。綜上所述，在此時期大麥葉片在進行充分地蠟質合成，初級醇的合成最活躍。210～240 d時，C26醇劇減，其他碳鏈長度的初級醇也有明顯降低(圖2)。

表1 大麥葉片蠟質各組分的相對含量Table 1 Relative contents of wax components of barley leaves %

圖2 大麥葉片蠟質不同碳鏈長度初級醇含量Fig.2 Content of different carbon chains of primary alcohols in barley leaf wax

2.3 大麥孕穗期及揚花期穗下莖和葉鞘的蠟質組分及含量

對大麥孕穗期和揚花期穗下莖和葉鞘蠟質進行分析，結果表明，穗下莖和葉鞘表皮蠟質主要成分均由烷烴、初級醇、醛、脂肪酸和二酮組成，以二酮含量高，初級醇次之，烷烴、醛和脂肪酸含量較少。大麥從孕穗期到揚花期，穗下莖和葉鞘蠟質總量及各組分含量均呈現增加的趨勢(圖3)。不同器官在不同時期蠟質各組分的含量不同，葉鞘蠟質總量均比穗下莖高。穗下莖中，二酮含量最高(73.84%～75.47%)，初級醇(7.97%～15.08%)、烷烴(8.25%～12.39%)和醛(1.65%～2.35%)次之，脂肪酸(0.87%～1.43%)最少；在葉鞘中，同樣是二酮含量最高(69.82%～86.85%)，初級醇(7.13%～16.35%)、烷烴(3.87%～7.96%)和醛(1.28%～3.79%)次之，脂肪酸(1.01%～2.07%)最少(表2)。在大麥揚花期，穗下莖和葉鞘蠟質各組分含量均達到最高，以二酮含量最高，分別達到了5.43 μg·cm-2和17.20 μg·cm-2(圖2)。

比較各蠟質組分的鏈長分布(圖4)發現，穗下莖中，不同碳鏈長度的烷烴以C31烷烴為主，其次是C29、C27和C25烷烴，C33烷烴最少，且在揚花期的含量均略高于孕穗期；初級醇主要由C22、C24、C26、C28和C30醇構成，其中，C30醇的含量最高，C26醇、C28醇和C24醇次之，C22醇最少，且在揚花期含量均明顯增加；醛以碳鏈長度為C24醛為主，其次是C30醛和C26醛，C28醛最少，且在孕穗期和揚花期間無明顯差異；脂肪酸主要由C22、C24、C26和C28酸構成，在孕穗期，C28酸占主導地位，在揚花期，C26酸占主導地位，C22和C24酸的含量在兩個時期差異不明顯。在葉鞘中，烷烴中C29烷烴含量最高，其次是C31、C27和C25烷烴，C33烷烴最少，且其在揚花期含量均較高，以C29烷烴的含量變化最明顯。初級醇各碳鏈長度醇含量依次為C30、C26、C28、C24和C22，且在揚花期的含量均較高，其中C30初級醇含量增加最明顯。不同碳鏈長度的醛以C30醛為主，其次是C24和C28醛，C26醛相對較少，且在揚花期的含量均明顯較高，其中C30醛的含量增加最明顯。不同鏈長的脂肪酸中，C28脂肪酸的含量最高，其次是C24和C22脂肪酸，C26脂肪酸最少，且在揚花期的含量均明顯較高，以C22脂肪酸增幅最大。結果表明，孕穗期和揚花期大麥各器官表皮中的不同鏈長的蠟質組分含量存在差異，且各組分在揚花期的含量均較高。

圖3 大麥孕穗期和揚花期不同器官中蠟質各組分含量Fig.3 Absolute contents of wax components in different organs of barley at booting stage and flowering stage表2 大麥孕穗期和揚花期不同器官表面蠟質各組分的相對含量Table 2 Relative contents of wax components in different organs of barley at booting stage and flowering stage %

圖4 大麥孕穗期和揚花期不同器官表面蠟質各組分不同碳鏈長度蠟質含量Fig.4 Absolute contents of wax in different organs of different carbon chains in barley at booting stage and flowering stage

由表3可知，不同時期大麥穗下莖和葉鞘表皮蠟質組分二酮差異程度不同。大麥孕穗期和揚花期，葉鞘中β-二酮的含量、羥基-β-二酮的含量及其總含量均高于穗下莖，經觀察，大麥揚花期葉鞘的白霜狀物質較孕穗期更明顯。穗下莖和葉鞘中β-二酮的含量均顯著高于羥基-β-二酮(P<0.05)。孕穗期，葉鞘中β-二酮、羥基-β-二酮及總二酮的含量顯著低于揚花期，與穗下莖中的含量差異均不顯著。

2.4 大麥不同時期葉片表皮蠟質晶體結構的變化

大麥葉片表皮蠟質晶體的掃描電鏡結果(圖5)顯示，大麥發育不同時期葉片上下表面的蠟質晶體均呈現片狀結構，且不均勻覆蓋在整個葉片表面上。不同發育時期表皮蠟質片狀晶體的密度存在明顯差異。在發育100 d時，片狀晶體分布較稀疏，且葉片上表面片狀晶體的分布較下表面更密集(圖5A、B)。隨著大麥的生長發育，片狀晶體的分布越來越致密，160 d(圖5E、F)和190 d(圖5G、H) 晶體分布最致密，與大麥葉片蠟質總量變化一致，210 d 片狀晶體相對較稀疏(圖5I、J)，240 d 時蠟質晶體致密程度基本保持不變(圖5K、L)。結合初級醇在各時期的含量變化推測，初級醇的生成可能是導致大麥葉片蠟質晶體呈現片狀的原因之一。

表3 大麥孕穗期和揚花期不同器官表皮蠟質二酮的絕對含量Table 3 Absolute contents of diketones in different organs in barley at flowering stage and mature stage μg·cm-2

同列數據后不同字母表示差異在0.05水平顯著。

Different letters following the values in same column indicate significant difference at 0.05 levels.

A和B:葉片上下表面(100 d)；C和D:葉片上下表面(130 d)；E和F:葉片上下表面(160 d)；G和H:葉片上下表面(190 d)；I和J:葉片上下表面(210 d)；K和L:葉片上下表面(240 d)。

A and B:Adaxial and abaxial surface of leaf(100 d); C and D:Adaxial and abaxial surface of leaf(130 d); E and F:Adaxial and abaxial surface of leaf(160 d); G and H:Adaxial and abaxial surface of leaf(190 d); I and J:Adaxial and abaxial surface of leaf(210 d); K and L:Adaxial and abaxial surface of leaf(240 d).

圖5大麥葉片表皮晶體的掃描電鏡觀察

Fig.5Cuticularwaxcrystalsontheleafsurfaceofbarley

2.5 大麥穗下莖和葉鞘表皮蠟質晶體結構

如圖6顯示，大麥穗下莖和葉鞘的蠟質晶體均呈棒狀結構。與孕穗期比較，揚花期穗下莖和葉鞘表皮蠟質晶體分布均更致密，其中，葉鞘表皮蠟質晶體變化較為明顯，且孕穗期和揚花期葉鞘表皮蠟質晶體較穗下莖更為致密。

3 討 論

本研究從大麥葉片、穗下莖和葉鞘表皮蠟質共鑒定出20種蠟質化合物，分別為烷烴、初級醇、醛、脂肪酸和二酮，其含量存在明顯差異，這與對擬南芥表皮蠟質組成的研究結果一致[7]。研究發現，擬南芥表皮蠟質的合成通路主要為合成初級醇的酰基還原途徑與合成醛、烷烴、酮的脫羰途徑兩種[16]。依據大麥葉片蠟質組分推測，大麥葉片表皮蠟質的合成途徑與擬南芥相似，但供試材料的穗下莖和葉鞘主要合成二酮，與擬南芥不同，這與羅文巧等[9]研究結果一致，推測大麥表皮蠟質的合成基因可能與擬南芥存在差異。

A:孕穗期穗下莖；B:揚花期穗下莖；C:孕穗期葉鞘；D:揚花期葉鞘。

A:Peduncle at booting stage; B:Peduncle at flowering stage; C:Leaf sheath at booting stage; D:Leaf sheath at flowering stage.

圖6大麥孕穗期和揚花期不同器官表皮蠟質晶體的掃描電鏡觀察

Fig.6Cuticularwaxcrystalsonthesurfaceindifferentorgansofbarleyatfloweringstageandmaturestage

不同時期大麥葉片表皮蠟質成分存在很大的差異，大麥從三葉期(100 d)到揚花期(190 d)蠟質含量逐漸增加，隨后逐漸降低并趨于穩定。穗下莖和葉鞘中蠟質總量變化趨勢同葉片，推測在大麥的揚花期(190 d)之前，大麥表皮處于蠟質合成和發育階段，蠟質合成活躍，各組織蠟質含量逐步增加。進入成熟期(210～240 d)后，蠟質合成減弱，蠟質發育基本完成，因此蠟質含量也降低。汪 勇等[17]研究發現，在小麥葉片發育早期(100 d)，初級醇的含量最高，隨后逐漸降低。而本研究發現，在大麥葉片發育早期(100 d)，初級醇的含量極低，隨后呈現逐漸增加的趨勢，并在190 d達到最高。推測可能是因為品種不同所致。分析不同碳鏈長度的蠟質組分，發現大麥葉片表皮蠟質成分主要是C22～C30偶數碳鏈長度的初級醇，以C26醇含量最高，其次是烷烴和醛，分別以C25～C33奇數碳鏈和C24～C30偶數碳鏈為主，二酮和脂肪酸的含量相對較少，其中脂肪酸的碳鏈長度以C22～C28偶數碳鏈為主。大麥葉片表皮蠟質組成中，C26初級醇的含量最高，且葉片上下表皮蠟質晶體均呈現密集的片狀結構，推測初級醇可能是使表皮蠟質呈現片狀晶體結構的主要原因，這與張蕓蕓等[18]發現小麥葉片下表皮蠟質晶體結構為柱狀的研究結果不同，可能由于大麥表皮蠟質組成與小麥存在差異。

大麥不同器官的表皮蠟質成分也存在很大的差異。孕穗期和揚花期穗下莖和葉鞘的蠟質主要成分為二酮，且蠟質晶體呈現棒狀形態，這與擬南芥莖稈的片狀晶體不同，與長角果莖稈的晶體形態一致[19]。Barthlott等[20]研究證明，棒狀晶體的形成主要是因為蠟質中的二酮成分比較高。本研究發現，葉鞘和穗下莖表皮二酮的含量顯著高于其他蠟質組分，且蠟質晶體呈棒狀形態，可初步認為大麥中蠟質晶體呈現棒狀形態與二酮有關。Zhang等[21]研究發現，二酮的含量是影響白霜狀表型差異的主要原因之一。本研究中，揚花期大麥葉鞘和穗下莖表面的有明顯白霜狀蠟質，推測大麥葉鞘和穗下莖表面的白霜狀與高含量二酮有關。植物表皮蠟質的合成及晶體形態與環境脅迫直接相關，干旱條件下植物為防止水分散失，表皮蠟質的含量普遍增多，且蠟質晶體密布植物表皮。一般認為蠟質含量越高，植物的抗旱性越強，抗病蟲害能力越好[22]。本研究中，大麥不同器官的表皮有著豐富的蠟質，這些蠟質成分對于大麥對抗干旱等逆境有著重要的作用。本研究首次對大麥葉片蠟質的發育進行了研究，分析了大麥不同組織的蠟質成分變化，對今后進一步研究大麥蠟質組分的合成機理奠定了基礎。

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