氯化膽堿對小麥幼苗耐低溫能力的生理調控效應

荊恩恩，高 翔，李宗震，張麗婷，余 幸，任永哲，王志強，辛澤毓，林同保

(河南農業大學農學院/河南糧食作物協同創新中心/省部共建小麥玉米作物學國家重點實驗室，河南鄭州 450002)

作為影響小麥生長發育的非生物脅迫因素之一，低溫往往造成小麥產量和品質下降[1]。低溫脅迫下，植株體內活性氧積累，細胞膜膜脂過氧化程度增加，膜磷脂脫脂化作用增強，從而引起膜結構改變。質膜系統的破壞會導致膜上酶活性紊亂，細胞代謝失調，進而致使小麥細胞死亡，影響植株的正常生長發育[2-4]。植物遭受低溫脅迫時，體內活性氧大量積累，膜脂過氧化產物丙二醛(MDA)含量上升，同時植物體內清除活性氧的抗氧化酶類，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性增強，有助于提高植物的耐受力[5-7]。此外，脯氨酸(Pro)作為植物體內重要的滲透調節物質，具有很強的親水性，能夠保護植物免受脫水的傷害，提升細胞膜結構的穩定性，從而提高植物抵御低溫脅迫的能力[8]。

植物生長調節劑在農業生產上應用廣泛，已成為增強植物抗逆性、提高作物產量的有效途徑之一[9]。氯化膽堿(CC)是一種季胺堿，進入植物體內后可以轉化成磷脂酰膽堿，而磷脂酰膽堿是構成生物膜的重要組成部分，因此在一定條件下施用氯化膽堿有助于減少膜脂損傷的程度，增加膜脂的流動性，從而增強植物的抗逆性[10]。鹽脅迫條件下，CC浸種可以降低質膜透性，減少MDA的含量，有效地緩解脅迫對小麥幼苗的損傷[11]。干旱脅迫條件下，CC葉面噴施可以有效地增加小麥葉片蛋白質的含量，降低MDA含量，從而緩解滲透脅迫對生長發育的影響，提高小麥抗旱能力[12]；噴施CC可以減少過氧化氫(H2O2)和超氧陰離子(O2-·)的含量，增加Pro的含量，提高地黃的抗干旱能力[13]。葉面噴施CC可以通過緩解膜損傷，增加抗氧化酶活性，提高玉米幼苗的抗寒能力[14]；或者通過降低MDA含量和電解質泄漏率，提高水稻的抗低溫能力[15]。目前，有關CC對小麥低溫適應的調控作用，國內外還鮮有報道。因此，本研究選用低溫敏感型品種開麥21和耐低溫型小麥品種周麥27為試驗材料，在人工氣候室內盆栽育苗，并模擬低溫條件進行處理，研究外源噴施CC對低溫脅迫下小麥幼苗形態指標和相關生理指標的影響，以期探究CC在小麥低溫適應過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

經過前期大田盆栽研究，本實驗室從河南省主要推廣的12個小麥品種中篩選出低溫敏感型品種開麥21和抗低溫型品種周麥27[16]，并且室內盆栽試驗的結果也驗證了這兩個品種的低溫響應模式與大田基本一致，因此，本試驗選取開麥21和周麥27為材料開展研究。

種子經過1%的次氯酸鈉消毒處理20 min，清水沖洗干凈，在清水中浸泡16～20 h，挑選飽滿度一致的種子，放在15 ×15 cm的玻璃皿中催芽48 h，最后篩選出發芽情況良好、長勢一致的種子種植于口徑為7.5 ×7.5 cm，高為10 cm的塑料小盆中，每盆種植小麥9株，培養基質為草炭土、蛭石1∶1混合制成。將栽有幼苗的小盆置于光照培養室內培養，培養室內光暗周期為16 h/8 h，溫度為23 ℃。在二葉一心期時噴施濃度為500 mg·L-1的CC，每間隔1 d噴施1次，一共噴施3次，以噴施蒸餾水為對照，噴施標準是噴施均勻不下滴。噴施結束后，置于原處繼續生長，待幼苗長至三葉一心期時在低溫培養箱內進行低溫處理，光暗周期為16 h/8 h，晝夜溫度為0 ℃/-5 ℃。低溫處理的時間共持續72 h，拍照記錄形態指標。在低溫脅迫0 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h時取第一片和第二片葉，每個處理收集3次生物學重復，-80 ℃保存待用。

1.2 測定項目和方法

1.2.1 形態觀察

低溫處理前進行一次拍照記錄，處理48 h后進行一次拍照記錄。

1.2.2 生理指標的測定

選取各處理小麥葉片，測定生理指標。其中，細胞膜通透性采用電導法測定[17]；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法[18]測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[18]測定；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法[17]測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫還原法[18]測定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法[17]測定；超氧陰離子自由基產生速率采用羥胺氧化法[19]測定。

1.3 數據分析

利用Microsoft Excel 2010進行數據計算和作圖，利用SPSS 19.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 低溫處理前后外源CC對小麥幼苗生長的影響

在正常條件下，無論噴施CC與否，開麥21和周麥27的幼苗長勢及長相變化均較小(圖1A和圖1C)。經過低溫處理48 h后，幼苗下部葉片嚴重萎蔫，而且周麥27葉片的萎蔫程度比開麥21輕。低溫下噴施CC后，開麥21和周麥27的幼苗長勢均好于對照(圖1B和圖1D)，說明外源CC有效減輕了低溫對小麥幼苗的損傷，提高了小麥的抗低溫能力。

2.2 低溫脅迫下外源CC對小麥葉片相對電導率的影響

隨著低溫脅迫時間的延長，開麥21和周麥27葉片的相對電導率均呈現持續上升的趨勢。低溫下噴施CC后小麥葉片相對電導率與對照相比均有所降低(圖2)，其中，在低溫脅迫24～72 h時，開麥21的噴施CC處理與對照差異極顯著或顯著，而周麥27只在低溫脅迫36 h和48 h時表現出顯著差異。這說明周麥27由低溫導致的膜損傷程度比開麥21輕，而且噴施CC可有效緩解低溫造成的膜損傷。

A、B、C、D中左盆為對照，右盆為CC處理。

The left and right pots are control and CC treatments,respectively.

圖1低溫脅迫下小麥幼苗的形態變化(左圖：開麥21；右圖：周麥27)

Fig.1Morphologicalchangesofwheatseedlingsundercoldtreatment(Left:Kaimai21;Right:Zhoumai27)

圖中*表示處理與對照間差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

* and ** indicate significance between the control and choline chloride at 0.05 and 0.01 levels, respectively. The same in the following figures.

圖2低溫處理下外源CC對小麥葉片相對電導率的影響

Fig.2Effectofcholinechlorideontherelativeconductivityofwheatleavesunderlowtemperature

2.3 低溫脅迫下外源CC對小麥葉片超氧陰離子(O2-·)產生速率的影響

低溫脅迫造成開麥21葉片O2-·產生速率在48 h內保持在較高的水平，之后下降；與之相比，周麥27葉片O2-·產生速率始終維持在一個相對較低的水平(圖3)，說明周麥27在低溫下，體內不會積累大量的活性氧，抵御低溫的能力較強。另外，與對照相比，噴施外源CC均降低了小麥葉片O2-·的產生速率。低溫脅迫0～48 h時，噴施CC后開麥21葉片中O2-·產生速率持續下降；而周麥27葉片中O2-·產生速率變化在低溫脅迫0～48 h時不明顯，只在脅迫60 h時降低了40.48%(P<0.01)(圖3)。

2.4 低溫脅迫下外源CC對小麥葉片SOD、POD、CAT活性的影響

與對照相比，在低溫脅迫開始時噴施CC后小麥葉片SOD活性較高，其中開麥21和周麥27分別增加26.70%和37.60%，均表現出顯著變化(P<0.01)；隨著低溫脅迫時間的延長，CC處理的SOD活性普遍高于對照。低溫脅迫24 h后，噴施CC后開麥21葉片SOD活性升高28.92%；低溫脅迫60和72 h時分別升高了23.23%和34.06%，與對照差異均顯著。周麥27的SOD活性變化在噴施CC后呈現相似趨勢(圖4)。

圖3 低溫處理條件下外源CC對小麥葉片超氧陰離子(O2-·)產生速率的影響Fig.3 Effect of choline chloride treatment on the production rate of superoxide anion(O2-·) in wheat leaves under low temperature

圖4 低溫處理條件下外源CC對小麥葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響Fig.4 Effect of choline chloride treatment on the activity of superoxide dismutase(SOD) in wheat leaves under low temperature

噴施CC對CAT和POD活性的影響與SOD相類似。CAT活性在低溫脅迫0～72 h內呈現下降趨勢，且CC處理均高于對照，在低溫脅迫0 h時噴施CC后，開麥21和周麥27的CAT活性分別增加35.99%和41.03%，且差異均顯著(圖5)。在低溫脅迫0～72 h內，兩品種的POD活性變化平緩，與對照相比，噴施CC后小麥葉片POD活性普遍較高，在低溫脅迫0 h時兩品種的POD活性分別增高18.51%和25.56%，差異均顯著(圖6)。

2.5 低溫脅迫下外源CC對小麥葉片丙二醛(MDA)含量的影響

開麥21葉片MDA含量在低溫脅迫36～60 h 時呈先增后降趨勢，在低溫脅迫72 h時又繼續升高；周麥27葉片MDA含量在低溫脅迫0～72 h 時也呈現先增后降的趨勢。在低溫脅迫48 h 時，開麥21和周麥27的MDA含量均達到一個較高的值，在低溫脅迫60 h時又出現下降的現象(圖7)，這與SOD活性在低溫脅迫60 h時出現一個峰值相對應；而在低溫脅迫48 h時，葉片SOD活性較低，因此在這個時間點葉片MDA含量較高。與對照相比，噴施CC后兩個品種的MDA含量均顯著降低，表明膜脂損傷減少，小麥的抗低溫能力增強。

圖5 低溫處理條件下外源CC對小麥葉片過氧化氫酶(CAT)活性的影響Fig.5 Effect of choline chloride treatment on the activity of catalase(CAT) in wheat leaves under low temperature

圖6 低溫處理條件下外源CC對小麥葉片過氧化物酶(POD)活性的影響Fig.6 Effect of choline chloride treatment on the activity of peroxidase(POD) in wheat leaves under low temperature

2.6 低溫脅迫下外源CC對小麥葉片脯氨酸(Pro)含量的影響

在低溫脅迫0～72 h時，噴施CC提高了小麥葉片Pro含量(圖8)，其中周麥27的Pro含量在低溫脅迫24和36 h時變化顯著，分別增加了44.62%和31.32%，而開麥21各時段變化均不顯著。這表明在低溫脅迫下噴施CC可有效增加小麥葉片的Pro含量，但與品種有關。

圖7 低溫處理條件下外源CC對小麥葉片丙二醛(MDA)含量的影響Fig.7 Effect of choline chloride treatment on the content of malonaldehydes(MDA) in wheat leaves under low temperature

圖8 低溫處理條件下外源CC對小麥葉片脯氨酸(Pro)含量的影響Fig.8 Effect of choline chloride on the content of proline(Pro) in wheat leaves under low temperature

3 討 論

低溫是影響小麥產量形成的主要災害之一，植物在受到低溫脅迫時，膜脂由液相變為凝膠相，影響膜脂平衡性，導致膜透性增加，電解質外滲，并且溫度越低，細胞膜透性改變的越大，膜損傷程度越深[20]。研究表明，低溫下細胞膜透性發生改變，導致玉米種子的發芽率和出苗率降低[21]；低溫弱光條件下，噴施CC可以有效地緩解黃瓜幼苗葉片的損傷[22]；低溫條件下，噴施CC的水稻幼苗電解質滲透率低于對照[15]。本試驗結果表明，低溫脅迫下，與對照相比，噴施CC后小麥幼苗電解質滲透率較低，表明外源CC有效地緩解了低溫脅迫傷害，與前人研究結果一致。另外，有學者認為，抗冷性強的植物的細胞膜透性小，抗冷性弱的植物的細胞膜透性大，電解質滲透率高，抗低溫能力弱[1]。本研究中，與開麥21相比，周麥27幼苗葉片的電解質滲透率較低，膜透性改變較小，抗低溫能力也較強。

活性氧是低溫脅迫下信號傳導過程中的重要調控因子。正常情況下，小麥植株體內的活性氧的產生與清除處于動態平衡的狀態，但當受到低溫脅迫的時候，小麥植株體內會產生過多的活性氧[23]，從而破壞抗氧化酶類的結構和組成，影響膜脂的平衡性，破壞膜結構和膜脂過氧化，MDA是膜脂過氧化的產物之一[24]。植物體內主要的抗氧化酶類包括SOD、POD和CAT，它們可以清除活性氧以及MDA等。周峰等[25]研究表明，外源CC可以有效緩解鹽脅迫對菠菜的損傷，增強SOD、POD、CAT等酶的活性，降低超氧陰離子和MDA含量。馬菁平等[14]認為，160 mg·L-1的CC預處理玉米幼苗，可以有效地降低玉米幼苗MDA的含量，增強抗氧化酶類SOD、CAT、POD的活性，提高玉米抗低溫能力。本試驗中，外源CC可有效地增加了小麥SOD、POD、CAT活性，減少了MDA和超氧陰離子的含量，增強了小麥植株對低溫的抵抗能力，與前人研究結果一致。

受到低溫脅迫時，植物體自身會產生一些滲透調節物質，抵御低溫造成的損傷。Pro是主要的滲透調節物質之一，可以提高蛋白質在水中的溶解度，并且維持各種酶類的結構[26]。祁春苗等[27]研究表明，干旱條件下，外源CC處理提高了地黃葉片的Pro含量。也有報道表明，低溫弱光處理的黃瓜幼苗葉片中Pro含量呈現先上升后下降的趨勢，而CC處理過的黃瓜幼苗葉片Pro含量均比對照高[22]。另外，在PEG脅迫條件下，CC處理的小麥幼苗葉片Pro含量比對照高[12]。本研究中，在低溫脅迫過程中，Pro的含量呈現先升高后降低的趨勢；與對照相比，噴施CC的小麥幼苗葉片的Pro含量較高，表明噴施CC可以提高小麥幼苗的抗低溫能力。

參考文獻：

[1] 趙黎明,李 明,鄭殿峰,等.冷害后植物生理變化及外源物質調控研究進展[J].中國農學通報,2015,31(12):218.

ZHAO L M,LI M,ZHENG D F,etal.Research progress of physiological changes and regulation of exogenous substance of chilling injury on plant [J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2015,31(12):218.

[2] POTTERS G,HOREMANS N,JANSEN M A K.The cellular redox state in plant stress biology—a charging concept [J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2010,48(5):292.

[3] 毛桂蓮,許 興,米海莉,等.NaCl脅迫下枸杞愈傷組織活性氧產生與質膜H+-ATPase活性的關系[J].干旱地區農業研究,2003,21(3):112.

MAO G L,XU X,MI H L,etal.Relationship between active oxygen production and plasma membrane H+-ATPase activity in calli ofLyceumbarbarumunder salt stress [J].AgriculturalResearchintheAridAreas,2003,21(3):112.

[4] YAMAMOTO Y,KOBAYASHI Y,MATSUMOTO H.Lipid peroxidation is an early symptom triggered by aluminum,but not the primary cause of elongation inhibition in pea roots [J].PlantPhysiology,2001,125:203.

[5] 張文靜,劉 亮,黃正來,等.低溫脅迫對稻茬小麥根系抗氧化酶活性及內源激素含量的影響[J].麥類作物學報,2016,36(4):502.

ZHANG W J,LIU L,HAUNG Z L,etal.Effect of low temperature on antioxidative enzymes activity and endogenous hormone content in wheat root of rice-wheat rotation [J].JournalofTriticeaeCrops,2016,36(4):502.

[6] 陳 龍,吳詩光,李淑梅,等.低溫脅迫下冬小麥拔節期生化反應及抗性分析[J].華北農學報,2001,16(4):45.

CHEN L,WU S G,LI S M,etal.Biochemical reaction and resistance analysis of jointing stage of winter wheat under low temperature stress [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,2001,16(4):45.

[7] 李春燕,陳思思,徐 雯,等.苗期低溫脅迫對揚麥16葉片抗氧化酶和滲透調節物質的影響[J].作物學報,2011,37(12):2297.

LI C Y,CHEN S S,XU W,etal.Effect of low temperature at seedling stage on antioxidation enzymes and cytoplasmic osmoticum of leaves in wheat cultivar Yangmai 16 [J].ActaAgronomicaSinica,2011,37(12):2297.

[8] KHEDR A H A,ABBAS M A,WAHID A A A,etal.Proline induces the expression of salt-stress-responsive proteins and may improve the adaptation ofPancratiummaritimumL.to salt-stress [J].JournalofExperimentalBotany,2003,54(392):2553.

[9] 李春喜,王言景,邵 云,等.化學調控劑不同施用方式對小麥抗凍性的影響[J].麥類作物學報,2010,30(2):384.

LI C X,WANG Y J,SHAO Y,etal.Effects of chemical-control reagents application on physuological and morphological indexes to cold tolerance of wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2010,30(2):384.

[10] CHE F S,CHO C,HYEON S B,etal.Metabolism of choline chloride and its analogs in wheat seedlings [J].PlantandCellPhysiology,1990,31(1):45.

[11] 陳 楚,張云芳,荊小燕.氯化膽堿浸種處理對鹽脅迫下小麥種子萌發以及幼苗生長的影響[J].麥類作物學報,2013,33(5):1030.

CHEN C,ZHANG Y F,JING X Y.Effects of seed soaking with choline chloride solution on seed germination and seedling growth of wheat under salt stress [J].JournalofTriticeaeCrops,2013,33(5):1030.

[12] 季玉龍,劉世名,陳靠山,等.氯化膽堿對小麥幼苗葉片在滲透脅迫下的影響[J].干旱地區農業研究,2002,20(1):57.

JI Y L,LIU S M,CHEN K S,etal.Effect of choline chloride on seedling leaves of wheat under osmotic stress [J].AgriculturalResearchintheAridAreas,2002,20(1):57.

[13] ZHAO H J,TAN J F,QI C M,Photosynthesis ofRehmanniaglutinosasubjected to drought stress is enhanced by choline chloride through alleviating lipid peroxidation and increasing proline accumulation [J].PlantGrowthRegulation,2007,51:255.

[14] 馬菁平,朱昌華,夏 凱,等.卵磷脂和氯化膽堿對玉米幼苗生長及抗冷性的影響[J].江蘇農業科學,2008(5):27.

MA J P,ZHU C H,XIA K,etal.Effects of lecithin and choline chloride on growth and cold resistance of maize seedlings [J].JiangsuAgriculturalSciences,2008(5):27.

[15] 梁煜周,何若天.氯化膽堿對低溫脅迫下稻苗的保護作用[J].中國水稻科學,1999,13(1):34.

LIANG H Z,HE R T.Protective effect of choline chloride on rice under chilling stress at seedling stage [J].ChineseJournalofRiceScience,1999,13(1):34.

[16] 孫苗苗,王志強,高 翔,等.河南主推小麥品種對低溫脅迫的生理響應及耐寒性分析[J].麥類作物學報,2016,36(3):318.

SUN M M,WANG Z Q,GAO X,etal.Cold tolerance evaluation of wheat varieties in Henan based on their physiological response to low temperature stress [J].JournalofTriticeaeCrops,2016,36(3):318.

[17] 高俊風.植物生理學實驗技術[M].西安：世界圖書出版社,2006:140-144,210-217.

GAO J F.Physiological experimental technology [M].Xian:World Publishing House,2006:140-144,210-217.

[18] 張志良.植物生理實驗指導[M].北京:高等教育出版社,1990:259-261.

ZHANG Z L.Handbook of plant physiology experiment [M].Beijing:Higher Education Press,1990:259-261.

[19] 王愛國,羅廣華.植物的超氧物自由基與羥胺反應的定量關系[J].植物生理學通訊,1990(6):57.

WANG A G,LUO G H.Quantitative relation between the reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals in plants [J].PlantPhysiologyCommunications,1990(6):57.

[20] YIN G,SUN H,XIN X,etal.Mitochondrial damage in the soybean seed axis during imbibition at chilling temperatures [J].PlantandCellPhysiology,2009,50(7):1313.

[21] 胡海軍,王志斌,陳鳳玉,等.玉米冷害生理機制研究進展[J].玉米科學,2009,17(2):149.

HU H J,WANG Z B,CHEN F Y,etal.Progress in reseachon cold damage physiological mechanism of maize [J].JournalofMaizeSciences,2009,17(2):149.

[22] 盛瑞艷,李鵬民,薛國希,等.氯化膽堿對低溫弱光下黃瓜幼苗葉片細胞膜和光合機構的保護作用[J].植物生理與分子生物學學報,2006,32(1):87.

SHENG R Y,LI P M,XUE G X,etal.Choline chloride protects cell membrane and the photosynthetic apparatus in cucumber seedling leaves at low temperature and weak light [J].JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2006,32(1):87.

[23] DAT J,VANDEMABEELE S,VRANOVA E,etal.Dual action of the active oxygen species during plant stress responses [J].CellularandMolecularLifeSciences,2000,57(5):786.

[24] 趙天宏,孫加偉,付 宇.逆境脅迫下植物活性氧代謝及外源調控機理的研究進展[J].作物雜志,2008(3):11.

ZHAO T H,SUN J W,FU Y.Advances of research on m etabolism of plant reactive oxygen species and exogenous regulation under abiotic stresses [J].Crops,2008(3):11.

[25] 周 峰,張邊江,華 春,等.氯化膽堿對低鹽處理下菠菜光合生理和抗氧化酶的效應[J].華北農學報,2012,27(1):164.

ZHOU F,ZHANG B J,HUA C,etal.Effect of choline chloride on photosynthetic physiology and antioxidant enzyme activity of spinach under low NaCl treatment [J].ActaAgriculturaeBoreali-Sinica,2012,27(1):164.

[26] 王茂良.植物抗滲透脅迫及其與脯氨酸的關系[J].北京園林,2006,22(2):24.

WANG M L.Plant resistance to osmotic stress and its relationship with proline [J].BeijingBotanicalGarden,2006,22(2):24.

[27] 祁春苗,張秀月,趙會杰.氯化膽堿對受旱地黃葉片滲透調節物質與光合的影響[J].河南農業科學,2007(1):86.

QI C M,ZHANG X Y,ZHAO H J.Effects of choline chloride on osmolytes and photosynthesis ofRehmanniaglutinosaunder drought stress [J].JournalofHenanAgriculturalSciences,2007(1):86.