金蛭方對缺血性中風大鼠caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

1.河北省遷安市中醫醫院，河北 遷安 064400；2.河北省遷安市人民醫院，河北 遷安 064400； 3.河北中醫學院，河北 石家莊 050000

缺血性中風所致腦損傷的病理機制尚不完全清楚，目前有多種研究，其中細胞調亡在缺血半暗帶損傷級聯反應過程中起著十分重要的作用[1]，因此關于神經細胞調亡機制的探索及基于抗調亡為靶點的治療藥物探究是缺血性中風的研究熱點。金蛭方系課題組經過多年篩選出的治療缺血性中風的效方，臨床應用10余年，療效明顯，但其作用機制不十分明確，本研究以期從細胞凋亡角度探討金蛭方對缺血性中風的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，清潔級，體重250～300 g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號：1119069。

1.2 藥物與試劑 金蛭方組成：水蛭、郁金、川芎、冰片(由遷安市中醫醫院制劑室制備)，上4味除冰片外水提濃縮成高、低劑量后加入相應研磨冰片，所含生藥分別為：0.30 g/mL(高劑量)、0.15 g/mL(低劑量)。尼莫地平片(鄭州瑞康制藥有限公司提供，國藥準字：H41022175，規格：20 mg/片)。按體重0.00 1g/mL配制成水溶液。

Caspase-3(ab13585)，Bcl-2抗體(ab692)，Bax抗體(ab77566)，Actin 抗體(ab5694)，bolt 封閉液(ab184868)均由艾博抗(上海)貿易有限公司提供。

1.3 主要儀器 DYCZ-24DN型雙垂直電泳槽(濟南德高實驗室設備有限公司)，DYCZ-40D型轉移槽(濟南德高實驗室設備有限公司)，LT-X型實驗室溫控搖床(Adolf Kuhner公司)，WH-300-LCD型電泳儀(上海雙琪生物科技有限公司)，AR0136-04型PVDF膜(博士德生物工程公司)。

1.4 造模方法 參考改良的Longa法[2]：頸部正中切口，用3-0手術絲線結扎頸外動脈(ECA)遠端及枕動脈，在結扎線距分叉部2 mm處剪斷ECA，將一端已加工成光滑球形的尼龍線從ECA殘端插入進行結扎，將尼龍線經頸總動脈(CCA)分叉部插入頸內動脈(ICA)，此時松開CCA，ICA套線恢復血流，線栓推送順滑，無出血。將線栓向上深入至分叉以上18～19 mm達到大腦中動脈開口處，將頸總動脈連同尼龍線一起結扎，縫合切口后外留尼龍線0.5 cm，放到單籠中，2 h后外拉尼龍線使其球端回至ECA進行缺血后再灌注。參照Longa評定法，進行神經功能缺損程度的評價，分為5個等級4分：0分，無明顯可見的缺損改變；1分，對側前肢可見屈曲、內收；2分，向偏擁側轉圈；3分，向偏雜側傾倒；4分，不能自主行走，意識不清；1～3分造模成功，0分與4分均為不合格模型，需要剔除。造模成功率100%。

1.5 實驗分組與給藥[3]60只大鼠自由進食飲水，飼養于18～22 ℃明暗各12 h的清潔級動物實驗室內，喂養1周后，隨機分為5組。①假手術組：手術時僅作頸部手術切口，鈍性分離頸前肌，游離暴露頸總、頸外、頸內動脈，術后當日灌服蒸餾水；②模型對照組(簡稱模型組)：造模當日灌服蒸餾水；③金蛭方低劑量組(簡稱低劑量組)：造模當日灌服金蛭方，每日用藥劑量為1.5 g/kg(相當于成人劑量的10倍)；④金蛭方高劑量組(簡稱高劑量組)：術后當日灌服金蛭方，每日用藥劑量為3.0 g/kg (相當于成人劑量的20倍)；⑤陽性藥尼莫地平片對照組(簡稱對照組)：術后當日灌服尼莫地平片，每日用藥劑量為0.01g/kg (相當于成人劑量的20倍)。各組1次/d灌胃，每次用藥體積均按1 mL/100g計算，連續給藥2周。因給藥操作不當，模型組低劑量組各死亡1只大鼠，高劑量組死亡2只大鼠。

1.6 檢測方法 實驗2周末，于最后1次給藥禁食12 h后，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速斷頭冰浴中取右腦皮質與白質部分，濾紙吸干血跡，將大鼠皮質部分放入凍存管，存入液氮中備用。

1.7 western-blot檢測蛋白含量

1.7.1 溶液配制 ①1.5M Tris-HC1(PH8.8)：準確稱量Tris堿18.15g，去離子水80 mL，用濃鹽酸調PH值至8.8，定容至,100 mL。②1.0M Tris-HC1(PH6.8)；準確稱量12.1g，去離子水80 mL，用濃鹽酸調PH值至6.8，定容至,100 mL。③10%過硫酸胺：準確稱量過硫酸胺0.1g溶于1 mL去離子水中，現用現配。④10%SDS：180 mL水中溶解20g電泳級SDS，加熱至68 ℃水浴助溶，用濃鹽酸調至PH值至7.2，加水定容至200 mL。⑤Tris甘氨酸電泳緩沖液(5×)：準確稱量堿15.1 g，甘氨酸94 g，SDS5 g，適量去離子水溶解，定容至1000 mL。⑥電轉移緩沖液：準確稱量甘氨酸2.9g， Tris堿5.8 g，SDS0.37 g，甲醇200 mL，加去離子水定容至1000 mL。⑦TBS-T(0.05%)：準確稱量Tris堿2.42 g，NaCl8 g，適量去離子水溶解，鹽酸調PH值至7.6，Tween-20 0.5 mL，加水定容至1000 mL。

1.7.2 祥本蛋白提取 依照電泳上樣量需要，用水及5×loading buffer調整蛋白濃度，100 ℃煮沸變性5 min。

1.7.3 丙烯酰胺凝膠電泳 ①根據目的蛋白的分子量，配制15%的分離膠，5%濃縮膠。②待檢測蛋白樣品上樣量：上樣50 μg。③電泳條件；濃縮膠恒壓80 v，約20 min；分離膠恒壓120 v，電泳至溴酚藍到凝膠底部。

1.7.4 濕轉轉膜 ①轉膜方法；準備一張大小合適的PVDF膜，浸泡于甲酵中30sec，再轉移至電轉液中，備兩張與膜大小一樣的厚濾紙浸泡于電轉液中備用；切除多余凝膠部分，按照濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序放入海綿墊夾層中，起盡氣泡。②轉膜條件：按照電流300 mA恒流轉膜；0.22 um孔徑PVDF膜，轉膜時間40 min

1.7.5 WB檢測目的蛋白 ①封閉；轉移結束后將PVDF膜浸泡于Western blot封閉液中，搖床中輕搖1 h。②一抗稀釋：用1%BSA/5%milk化稀釋一抗。③一抗孵育：封閉結束后，將PVDF膜置于雜交袋中，加入2中配制好的一抗，用封膜機封口，4 ℃解育過夜。④洗膜；TBST洗膜3次，每次6 min。⑤二抗孵育：用Western blot封閉液稀釋二抗，羊抗兔-HRP、羊抗小鼠-HRP1：5000稀釋，室溫輕搖50 min。⑥洗膜：TBST洗膜3次，每次5 min。⑦ECL反應、膠片曝光：將PVDF膜浸泡于ECL顯色液中1 min，暗室中曝光、顯影并定影。

2 結果

模型組大鼠缺血側皮質區Bcl-2蛋白表達較假手術組明顯降低(P<0.01)；caspase-3、Bax蛋白表達較假手術組明顯升高(P<0.01)。用藥后各治療組大鼠缺血側皮質區Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)；caspase-3、Bax蛋白表達明顯降低(P<0.05，P<0.01)。高、低劑量組在增強Bcl-2蛋白表達和降低caspase-3、Bax蛋白表達方面的作用優于對照組(P<0.05)。詳見圖1，表1。

組別鼠數caspase-3BaxBcl-2假手術組120.204±0.017??0.241±0.026??0.943±0.031??模型組110.558±0.0420.667±0.0430.361±0.037高劑量組100.213±0.043??▲0.349±0.064??▲0.566±0.023??▲低劑量組110.295±0.063??▲0.342±0.0321??▲0.551±0.038??▲對照組120.416±0.037?0.457±0.0841??0.476±0.056??

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與對照組比較，▲P<0.05。

3 討論

課題組通過對中風病臨床癥候學研究認為缺血性中風患者多是在氣血內虛的基礎上，加之勞倦內傷、憂思惱怒、嗜食厚味、煙酒等誘因，導致氣血逆亂，直沖犯腦，致氣血瘀滯，腦脈痹阻。氣滯、血瘀、絡阻為本病的主要病機，“氣行則血行”，行氣、活血、通絡為其有效治則，筆者根據金蛭方，研制院內制劑“金蛭膠囊”(制劑號：冀藥制字Z20051013)治療缺血性中風10余年，療效滿意。方中水蛭破血逐瘀、通經活絡，《本草匯言》曰：“水蛭逐惡血、散瘀血之要藥也”；郁金行氣活血，化痰降火，《本草匯言》曰：郁金其性清揚，能散郁滯，順逆氣，上達高巔，善行下焦；川芎行氣活血，歷代醫家認為其：“善治中風，治風圣藥”[4]；冰片醒神通竅，《本草衍義》曰：“芳香走竄，引藥上行，獨行則勢弱，佐使則有功”，四藥合用，共奏活血、化瘀、通絡之功。

程序性死亡是保持細胞生存和死亡間平衡的關鍵因素。而凋亡作為程序性死亡的最主要類型，一直是醫學研究的熱點[5]。在缺血性腦損傷中，與壞死的細胞相比，凋亡細胞僅占死亡細胞總數的小部分[6]，而就缺血半暗帶而言，凋亡細胞死亡卻是最主要的死亡方式[7]。Caspase-3是Caspase家族成員之一，它在細胞調亡執行階段中起著核心作用，活化的Caspase-3導致神經元細胞DNA斷裂，抑制細胞増殖，并且破壞細胞之間的平衡狀態[8]。Caspase-3表達上調的細胞調亡是缺血性和出血性腦損傷的重要標志[9]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡過程中的調控基因，Bcl-2蛋白具有抑制細胞調亡的功能，Bax蛋白則具有促進細胞調亡的功能[10]。Bcl-2通過介導線粒體外膜通透轉運孔道復合體的開放，抑制和調亡誘導因子AIF等促調亡蛋白的釋放阻止調亡的進程。Bax只有收到調亡信號刺激被激活后，發生分子構造改變，移位并插入線粒體外膜后形成Bax大孔道，破壞線粒體膜的完整性，并與Bcl-2等抑制調亡的蛋白對抗，阻止其抗調亡作用的發揮。因此，檢測caspase-3和Bcl-2、Bax缺血性卒中后的表達情況，即可說明細胞調亡的狀況。

本研究表明，缺血性中風大鼠模型缺血側皮質區caspase-3、Bax蛋白表達明顯升高，Bcl-2蛋白表達明顯降低。經藥物干預后，各治療組可降低大鼠模型缺血側皮質區caspase-3、Bax蛋白表達，升高Bcl-2蛋白表達表達，表明金蛭方通過調節caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達，以達到減輕腦缺血細胞凋亡、改善神經功能、預防和治療缺血性中風的作用，但其深入的作用機制有待進一步的探討。

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