醒腦益智劑聯(lián)合羅格列酮改善2型糖尿病小鼠記憶障礙的作用機(jī)制

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610072；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610042； 3.重慶市中醫(yī)院，重慶 400010；4.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610072

糖尿病性記憶障礙也可稱為“3型糖尿病”[1-2]，是老年期癡呆中較為常見的一種慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)性病變[3-4]。根據(jù)長期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，本病多以腎虛為本，痰濁、血瘀為標(biāo)[5-6]，從而確立了以“胰-腎-腦”軸為指導(dǎo)的補(bǔ)腎醒腦法，現(xiàn)已制成院內(nèi)合劑-醒腦益智劑，但其作用機(jī)制尚未明確。故本實(shí)驗(yàn)在建立穩(wěn)定的2型糖尿病性記憶功能障礙小鼠模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察并明確醒腦益智劑對2型糖尿病性記憶功能和大腦胰島素信號傳導(dǎo)通路的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 中藥處方包括熟人參、地黃、川芎、粉葛、冰片、山藥等，由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供并制備。陽性對照品為馬來酸羅格列酮片[商品名文迪雅，葛蘭素史克(天津)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20020475]，購于成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.2 試劑 Western Blot一抗購自Cellsignal公司，二抗購自北京博奧森生物公司。

1.3 動物 SPF級雄性10周齡健康C57BL小鼠16只，體重26～35 g；SPF級雄性10周齡健康KKAy小鼠80只，高脂高糖飼料(10%蔗糖、10%脂肪、基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)8周，血糖穩(wěn)定后改為基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。以上動物及飼料均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供[許可證號SCXK(京)2009-0004]。實(shí)驗(yàn)中動物自由攝食及飲水，取材前禁食12 h，溫度(23±2)℃，相對濕度26%～29%。

1.4 儀器 One-Touch-II快速血糖儀及血糖試紙(美國強(qiáng)生公司)；顯微鏡(日本奧林巴斯BX51T-PHD-J1)；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)(Image-Pro Plus，美國Media Cybernetics 公司)；醫(yī)用X射線膠片(柯達(dá)公司，美國)。

1.5 方法

1.5.1 造模和分組 C57BL小鼠16只，由基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，為正常對照組。Kkay小鼠80只，高糖高脂飼料喂養(yǎng)6周后檢測隨機(jī)血糖≥13.9 mmol/L為造模成功，隨機(jī)分為模型對照組、陽性對照組和聯(lián)合給藥高、中、低劑量組，每組16只。

1.5.2 給藥 陽性組每天用馬來酸羅格列酮片按小鼠體重(0.003 g/kg)灌胃，聯(lián)合給藥大、中、小劑量組每日分別用馬來酸羅格列酮片(0.003 g/kg)和醒腦益智劑生藥(3.6、7.2、14.4 g/kg)灌胃，正常組和模型組每天用等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)42 d。

1.5.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 分組前及給藥后各進(jìn)行一次。前4天為隱藏平臺實(shí)驗(yàn)，限定時間90 s，若小鼠找到平臺，使之于平臺休息30 s；如90 s未找到平臺，將小鼠撈起并放于平臺休息30 s，并將時間記錄為90 s。第5天為空間搜索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺，記錄小鼠在90 s內(nèi)第1次找到平臺區(qū)的時間及找到平臺的次數(shù)。數(shù)據(jù)采集及圖像分析均由圖像自動監(jiān)視和處理系統(tǒng)完成。

1.5.4 取材及標(biāo)本制作

1.5.4.1 免疫組化樣本 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，抽簽法每組選取8只小鼠，0.1% DCPC(0.1%去乙酰頭孢菌素C)溶液處理并高壓蒸汽消毒相關(guān)手術(shù)器械，按小鼠體重3 ml/kg腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，生理鹽水經(jīng)左心室灌注后取全腦，4 ℃4%多聚甲醛固定24 h，取包括海馬、大腦額葉皮質(zhì)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋后連續(xù)冠狀切片。

1.5.4.2 Western blotting樣本 水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，抽簽法每組選取8只小鼠， 3.5%水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉后無菌操作開顱取海馬、大腦額葉皮質(zhì)，勻漿后取上清液制備Western Blotting樣本。

1.5.5 檢測方法

1.5.5.1 每周1次斷尾取血法監(jiān)測血糖。

1.5.5.2 免疫組化方法 檢測小鼠海馬組織中PI-3K/Akt蛋白活性。先采用100倍顯微鏡觀察小鼠大腦海馬區(qū)，每個樣本取6張相同部位的腦切片，然后在200倍光鏡下選擇5個相鄰視野對陽性細(xì)胞(棕黃色胞漿)進(jìn)行觀察，最后采用Image-Pro Plus軟件測定光密度值。

1.5.5.3 Western Blotting 檢測小鼠海馬組織中GSK-3β的活性、Tau蛋白總量及Tau蛋白磷酸化水平。用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，并分離蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上加一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，充分顯影曝光并照相保存。

2 結(jié)果

2.1 體重和血糖 給藥前Kkay小鼠體重(g)和血糖(mmol/L)均明顯大于正常對照組C57BL小鼠體重(P<0.05)；給藥后，正常組血糖水平變化不大，模型組血糖水平明顯升高并高于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相較于正常組C57BL小鼠，轉(zhuǎn)基因KKay小鼠養(yǎng)至第18周齡時即已出現(xiàn)輕度記憶障礙，并隨時間推移、血糖升高而逐漸加重且波動不大，說明其作為2型糖尿病性記憶障礙模型已成熟穩(wěn)定。見表1。

組別劑量/g/kg體重/g血糖/mmol/L給藥前正常組-25.64±1.28 7.55±0.67 給藥前KKay組-37.93±5.03# 20.81±3.37#給藥后正常組-28.03±1.328.03±1.17△給藥后模型組-39.18±2.23△24.32±3.89△給藥后陽性組0.003 39.09±1.76△14.87±3.26?△□給藥后聯(lián)合給藥大劑量組0.06+0.00339.77±3.48△15.98±4.95?△□給藥后聯(lián)合給藥中劑量組0.03+0.00338.72±1.48△13.85±4.15?△□給藥后聯(lián)合給藥小劑量組0.015+0.00339.38±2.59△14.76±4.03?△□

注：與給藥前比較，*P<0.01；給藥前與正常組比較，#P<0.05；給藥后與正常組比較，△P<0.05；給藥后與模型組比較,□P<0.05。

2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 給藥后潛伏期比較，聯(lián)合給藥組和正常組第5天比第1天明顯縮短，且明顯小于模型組和陽性組；平臺象限概率比較，聯(lián)合給藥組和正常組明顯大于模型組和陽性組。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說明在使用羅格列酮改善胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，醒腦益智劑可有效改善2型糖尿病小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。見表2。

組別劑量/g·kg-1第1天潛伏期/s 第5天潛伏期/s 平臺象限概率正常組-64.88±29.03?58.19±25?1.711?模型組- 86±7.4775.93±20.620.38陽性組0.00385.53±8.7167.53±32.560.75聯(lián)合給藥大劑量組0.06+0.00374.37±20.23?56.13±24.11?1.573?聯(lián)合給藥中劑量組0.03+0.00370.14±13.42?51.41±18.38?1.164?聯(lián)合給藥小劑量組0.015+0.00380.25±15.23?59.14±19.62?1.353?

注：與模型組比較，*P<0.05。

2.3 Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各組小鼠大腦海馬中Tau蛋白總量差異不大。與模型組相比，正常組和聯(lián)合給藥組在Ser396位點(diǎn)上Tau蛋白磷酸化水平明顯偏低，GSK-3β活性明顯偏高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Tau蛋白的過度磷酸化是2型糖尿病性記憶障礙重要的病理改變[8]，而GSK-3β活性升高是其主要原因。在改善胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，醒腦益智劑可以有效降低GSK-3β活性并糾正Tau過度磷酸化水平。見表3。

表3 醒腦益智劑對海馬內(nèi)Tau、P-tau、GSK-3β及Ins R的影響 (n=8)

注：與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。

2.4 免疫組化結(jié)果 模型組和陽性組PI-3K/Akt染色陽性表達(dá)不明顯，正常組PI-3K/Akt染色陽性表達(dá)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其主要表現(xiàn)為胞漿甚至細(xì)胞核呈黃褐色；與模型組和陽性組相比較，聯(lián)合給藥組PI-3K/Akt陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞分級均明顯高于模型組和陽性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明醒腦益智劑能有效增強(qiáng)海馬中PI-3K活性表達(dá)，而PI-3K活性的異常降低是引起GSK-3β活性升高和Tau過度磷酸化的關(guān)鍵因素。見表4。

表4 陽性細(xì)胞記數(shù)及免疫組化評分(5個視野)

注：評分標(biāo)準(zhǔn)： A為陽性細(xì)胞數(shù)分級0%～1%=0；1%～10%=1；10%～50%=2；50%～80%=3；80%～100%=4。B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級0(陰性)、1(弱陽性)、2(陽性)、3(強(qiáng)陽性)IHS=A×B。與模型組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01。

3 討論

腦內(nèi)胰島素功能復(fù)雜，其水平異常是促使記憶障礙發(fā)生的重要原因[8-12]。2型糖尿病是引發(fā)癡呆的重要因子之一，其可能的發(fā)病機(jī)制為大腦皮質(zhì)及海馬中存在PI-3K活性的降低、GSK-3β活性增高和Tau蛋白的過度磷酸化[8]，即胰島素抵抗產(chǎn)生的信號傳導(dǎo)障礙[9]。胰島素信號系統(tǒng)功能低下時，會導(dǎo)致下游途徑中磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K)下降，從而導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化的主要糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)活性增高[13-14]。因此，研究不同的胰島素水平對PI-3K活性以及Tau蛋白過度磷酸化程度的影響，從分子水平上解釋糖尿病與記憶障礙的關(guān)系及致病機(jī)制，并在組織細(xì)胞凋亡的同時預(yù)防和延緩神經(jīng)細(xì)胞的退行性變方面都具有重要的意義[15]。

在臨床上，張發(fā)榮教授以腦為軸心的“胰(脾)-腦-腎軸”的消渴呆病病機(jī)學(xué)說為基礎(chǔ)，廣泛運(yùn)用補(bǔ)腎醒腦法治療老年性癡呆(包括血管性癡呆)，取得較好療效[16]。《靈樞·海論》云：“腦為髓之海，諸髓皆屬于腦”。腎主藏精，為先天之本，是腦髓生成的物質(zhì)基礎(chǔ)，故有“腎生腦”之說。消渴日久，陰虛燥熱，灼精耗液，脾腎虧耗，損及腦髓。在消渴呆病的發(fā)病環(huán)節(jié)中，根源為腦髓空虛，本質(zhì)是腎精虧虛，始動因子為胰(脾)。治療以補(bǔ)腎醒腦為根本大法，在控制血糖的基礎(chǔ)上，以阻止智能衰減為最終目標(biāo)，在《備急千金要方》所載開心散及張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》所載滋脺飲的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床實(shí)踐，形成了醒腦益智劑。

在臨床觀察研究的基礎(chǔ)上，研究在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下動物模型的記憶功能及海馬PI-3K、GSK-3β的活性和Tau蛋白過度磷酸化的修飾水平發(fā)現(xiàn)，醒腦益智劑可有效提高2型糖尿病性記憶障礙小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，增強(qiáng)大腦皮質(zhì)及海馬組織中PI-3K表達(dá)，降低GSK-3β活性，糾正Tau蛋白的過度磷酸化，改善大腦組織中胰島素信號傳導(dǎo)通路，這也為祖國醫(yī)學(xué)進(jìn)一步防治糖尿病性記憶障礙提供了理論依據(jù)。

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