當歸調經養血合劑提取工藝研究

廣東省陽江市中醫醫院，廣東 陽江 529500

當歸調經養血合劑為我院婦科常用的臨床經驗方，由山茱萸[1]等13味中藥組成，具有補血，益氣、填精功效、治氣血衰弱，腎精不足所致月經后期、月經過少、閉經、痛經、更年期綜合癥、不孕等癥。馬錢苷為方中主藥山茱萸的主要有效成分，具有調節免疫、抗炎、降血糖等多種功效[2]。本研究采用正交實驗法，以水煎提取液中馬錢苷的含量和相對密度為考察指標，對當歸調經養血合劑的水提取工藝進行優選，為其進一步的研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津公司LC-20AD高效液相色譜儀(LabSolutions色譜工作)站；SB25-12DTD型數控超聲清洗器(上海新芝生物科技股份有限公司)；AB 135-S十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多)；AB204-N型萬分之一天平(梅特勒-托利多)；超純水機(北京歷元電子儀器)。

1.2 材料 馬錢苷對照品(批號110640-201606，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈(色譜純，批號：1307184A，默克股份兩合公司)；甲醇(色譜純，批號：1301095A，默克股份兩合公司)；所用試劑水均為超純水。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計 根據預試驗及生產實踐，當歸調經養血合劑提取工藝采用水煎煮提取的方式，影響水提效果的主要因素為加水量(A)，提取時間(B)、提取次數(C)[3-4]。 選用L9(34)正交設計試驗。見表1。

表1 正交因素水平表

2.2 樣品提取液的制備 按處方比例稱取9份混合中藥飲片，按擬定的正交試驗方案進行水煎煮提取。每份加水后均浸泡1 h，所得煎煮液濃縮至100 mL，相當于每1 mL含生藥0.77 g。

2.3 相對密度 按《中國藥典》2015年版第四部通則0601相對密度測定法測定。

2.4 馬錢苷含量測定[5-7]

2.4.1 色譜條件 ZORBAX SB-C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(10∶90)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm；柱溫；25 ℃；進樣量：10μL。馬錢苷對照品，當歸調經養血合劑樣品和缺山茱萸的陰性對照樣品的HPLC色譜。如圖1所示。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取馬錢苷對照品6.64 mg，置100 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品儲備溶液(質量濃度為0.0664 mg/mL)。精密量取3 mL對照品儲備溶液，置10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得對照品溶液(質量濃度為0.0199 mg/mL)。

2.4.3 供試品溶液的制備 分別精密吸取“2.2”項下濃縮液各5 mL，置于50 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45μm濾膜過濾，取過濾液為供試品溶液。

2.4.4 線性關系考察 精密吸取對照品儲備溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于10 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成0.0066、0.0133、0.0199、0.0265、0.0332、0.0398 mg/mL的系列溶液，分別吸取上述溶液各10 μL，進行進樣測定，以縱坐標(Y)為峰面積，以橫坐標(X)為質量濃度(mg/mL)進行線性回歸，得線性方程為Y=21905X-0.9030，相關系數r=0.9999。線性范圍在0.0066～0.0398 mg/mL，呈良好的線性關系。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液，重復進樣6次，每次進樣10μL，按上述色譜條件測定，以峰面積計算，RSD值為0.23%(n=6)。結果表明儀器的精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別放置0、1、2、4、8、24 h后，按上述色譜條件測定色譜峰面積，RSD值為1.13%(n=6)，結果顯示在24 h內供試品溶液穩定性相對良好。

2.4.7 重復性試驗 精密量取同批次樣品各6份，按“2.4.3”供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，測定并計算馬錢苷含量，結果含量的RSD值為0.01%(n=6)，結果表明該方法具有良好的重復性。

2.4.8 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的同一批供試品溶液6份，分別加入相當于各對照品溶液80%、100%和120%的量，在“2.4.1”色譜條件下檢測馬錢苷的回收率分別為99.13%、100.45%、100.93%，平均回收率為100.21 %；RSD值為3.68 %(n=6)，該方法回收率良好。見表2。

表2 加樣回收率試驗

2.5 結果與分析

2.5.1 水煎提取正交試驗結果 根據L9(34)正交試驗，以馬錢苷含量和水提取液相對密度為主要考核指標，設定權重系數分別為0.6、0.4，綜合評分=(相對密度/最大相對密度)×0.4×100+(馬錢苷含量/最大馬錢苷含量)×0.6×100。研究選擇提取次數、加水量、提取時間為主要考察因素，由表3可見其影響順序為C(提取次數)>A(加水量)>B(提取時間)，水平影響次序為A3>A2>A1，B3>B2>B1，C2>C3>C1，故最佳提取工藝為A3B3C2。再經方差分析結果(表4)可知提取次數(C)和加水量(A)對提取效果影響顯著，為主要因素，提取時間(B)對提取效果無明顯影響，為次要因素。考慮節約成本，將B3調整為B2。調整最優的提取工藝為A3B2C2，即8倍的加水量，煎煮2次，每次煎煮1.5 h。

表3 水煎提取正交試驗結果

表4 方差分析結果

注:F0.05(2,4)=6.94，F0.01(2,4)=18.00

2.6 驗證試驗 稱取與正交試驗等量飲片3份，按優選的提取工藝提取，測得相對密度的RSD為0.08%，馬錢苷含量RSD為0.81%，表明優選的工藝穩定可行。見表5。

表5 驗證試驗結果

3 討論

有研究曾以方中君藥當歸中的阿魏酸作為含量測定指標成分，發現阿魏酸含量測定的方法學驗證中專屬性不強，陰性對照液相色譜圖的干擾成分除了來自川芎的阿魏酸成分干擾，還來自其它藥材的阿魏酸成分干擾[9-10]。故沒有選擇當歸中的阿魏酸為提取工藝指標，而選擇臣藥山茱萸中的馬錢苷作為提取工藝的指標。

山茱萸主要成分有環烯醚萜類化合物，而馬錢苷是山茱萸補益肝腎的主要藥效物質，且其水溶性和熱穩定性相對良好，故研究選擇馬錢苷含量作為提取工藝主要的評價指標進行綜合評分。另外方中飲片成分水溶性強，出膏率大，故選擇能反映出膏率大小的相對密度作為評價指標之一，并在綜合加權評分賦予相對密度40%的比重。此外，綜合分析本組研究情況，精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗、加樣回收率試驗和驗證試驗等結果均良好，正交試驗的方差分析結果也準確可靠，達到了優選出當歸調經養血合劑的最佳提取工藝的目的。當歸調經養血合劑中山茱萸主要成分馬錢苷的最佳提取工藝為8倍的加水量，煎煮2次，每次煎煮1.5 h，可作為后續相關提取研究的基礎和參考。

實驗未對提取液的最佳pH條件進行分析，僅以馬錢苷作為指標成分和相對密度進行優選，研究仍存在一定局限性。但本次工藝研究最大的意義在于采用水溶液為提取溶劑，既能最大限度地節約成本，同時也能高效提取馬錢苷，適合工業化生產。

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