骨疏寧口服液提取工藝的研究

廣西壯族自治區(qū)玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院，廣西 玉林 537000

骨疏寧方是全國名老中醫(yī)賴祥林的經(jīng)驗(yàn)方，由淫羊藿、骨碎補(bǔ)、制何首烏、丹參、續(xù)斷等中藥組成，主治老年性骨質(zhì)疏松癥。前期試驗(yàn)表明骨疏寧方有抗維甲酸及去卵巢所致大鼠骨質(zhì)疏松癥作用；可治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松癥引起的骨折、骨痛[1-4]。為推廣該方在臨床上的應(yīng)用，結(jié)合本方各藥主要有效成分易溶于水的特點(diǎn)，擬將該方開發(fā)成口服液體制劑。本實(shí)驗(yàn)采用單因素考察、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以淫羊藿苷含量及干膏量為指標(biāo)，優(yōu)選骨疏寧口服液最佳提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)藥材與儀器

1.1 藥材與試劑 淫羊藿、骨碎補(bǔ)、制何首烏、丹參、續(xù)斷等十九味中藥均購自玉林市平安堂中藥飲片有限公司，經(jīng)鑒定，均符合《中國藥典》2015年版相關(guān)項(xiàng)下要求。淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號110737-200415)，乙腈(Fisher；色譜純)，95%乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)。

1.2 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津)，AB204-S型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)，DHG-9006型9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏)

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿苷含量的測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為C18柱(Inertsil ODS-SP， 5μm，4.6 mm×150 mm)，流動相為乙腈-水(30∶70)；流速為1 mL/min，檢測波長為270 nm，進(jìn)樣量為10μL。理論塔板數(shù)以淫羊藿苷計(jì)算為1500。

2.1.2 對照品貯備液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品0.0135 g，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品母液。精密吸取1.0 mL對照品母液置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液(0.0108 mg/mL)。

2.1.3 供試品溶液的制備 按處方比例稱取藥材，加20倍水，浸泡30 min后，煎煮2 h，濾過，濃縮，定容至100 mL容量瓶中作為供試品儲備液。精密量取上述儲備液10 mL，置聚酰胺層析柱(100～200目，6 g，內(nèi)徑為1.5 cm)上，用蒸餾水100 mL洗脫，水洗液棄去，再用95%乙醇100 mL洗脫，收集醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓哭D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中并定容，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即為供試品溶液，檢測結(jié)果如圖1所示。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.1.2項(xiàng)下對照品貯備液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL，按2.1.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，以對照品進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明淫羊藿苷對照品進(jìn)樣量在0.06～0.36 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。回歸方程為y=1940560.35x-274.13(R2=0.9999，n=6)。

2.2 干膏量的測定 精密量取供試品貯備液50 mL，置經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，蒸干，105 ℃干燥3 h，取出冷卻，稱定重量，計(jì)算藥材的干膏量。

2.3 單因素考察與結(jié)果

2.3.1 提取時間的研究 按處方比例稱取一定量的藥材，各加入20倍的水，浸泡30 min后，分別煎煮1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h，濾過，濾液濃縮至100 mL，測定淫羊藿苷含量及藥材干膏量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取2.5 h、3 h、3.5 h的淫羊藿苷含量趨平，因此，選擇提取時間2.5 h、3 h、3.5 h設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。見表1。

表1 提取時間研究結(jié)果

2.3.2 提取次數(shù)的研究 按處方比例稱取一定量的藥材，各加入20倍的水，浸泡30 min后，分別提取1次(時間3.5 h，加水20倍)、2次(時間2 h+1.5 h，加水11倍+9倍)、3次(時間1.5 h+1 h+1 h，加水8倍+6倍+6倍)，濾過，收集濾液，測定淫羊藿苷含量和藥材的干膏量，確定最佳提取次數(shù)。隨著提取次數(shù)的增多，淫羊藿苷含量、干膏量均逐漸增大，但2次以后，淫羊藿苷含量、干膏量均增長緩慢，為減少能耗，選擇提取1次、2次、3次設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。見表2。

表2 提取次數(shù)研究結(jié)果

2.3.3 提取倍數(shù)的研究 按處方比例稱取一定量的藥材，分別加18(10+8)倍、20(11+9)倍、22(12+10)倍、24(13+11)倍、26(14+12)倍的水，浸泡30 min后，煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h，濾過，收集濾液，測定淫羊藿苷含量和藥材的干膏量，確定最佳提取倍數(shù)。隨著提取倍數(shù)的增加，淫羊藿苷含量、干膏量逐漸增加，22倍后增加緩慢，不適當(dāng)?shù)脑黾犹崛∪軇粌H浪費(fèi)溶劑、能源，還給后續(xù)的濃縮工藝加大難度，因此，選擇20倍、22倍、24倍設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。見表3。

表3 提取倍數(shù)研究結(jié)果

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳提取工藝

2.4.1 因素水平設(shè)計(jì) 通過單因素試驗(yàn)確定了提取時間、提取次數(shù)、提取倍數(shù)的因素范圍，并在其基礎(chǔ)上確定以下因素及水平。見表4、5。

表4 提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

表5 骨疏寧口服液提取工藝正交試驗(yàn)因素水平表

2.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用L9(34)正交試驗(yàn)，以藥效成分淫羊藿苷含量及評價中藥提取效果的參考指標(biāo)干膏量的綜合評分為指標(biāo)，進(jìn)行綜合加權(quán)評分，考察各因素對提取工藝的影響。本研究采用經(jīng)驗(yàn)性權(quán)重法，根據(jù)評價指標(biāo)的重要性確定權(quán)重系數(shù)：淫羊藿苷含量為60，干膏量為40。綜合評分=淫羊藿苷含量/最大淫羊藿苷含量×60+干膏量/最大干膏量×40。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表6 骨疏寧口服液提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

續(xù)表6

表6 骨疏寧口服液提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

2.4.3 方差分析結(jié)果 根據(jù)正交試驗(yàn)分析結(jié)果和直觀分析可知，主次因素依次為C>B>A，即提取次數(shù)影響最大，其次為提取時間、提取倍數(shù)，最佳試驗(yàn)條件為A1B3C2，即處方藥材分次加20(11+9)倍水，煎煮2次，第一次2 h，第二次1.5 h。見表7。

表7 骨疏寧口服液提取工藝正交試驗(yàn)方差分析

注：F005(2，2)=19；F001(2，2)=99

2.6 最佳提取工藝驗(yàn)證 根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取工藝，進(jìn)行了3批樣品的驗(yàn)證試驗(yàn)，綜合評分RSD為1.83%，結(jié)果表明該提取工藝穩(wěn)定，可行，重復(fù)性好。工藝驗(yàn)證結(jié)果見表8。

表8 工藝驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

方中君藥淫羊藿作為常用的補(bǔ)腎健骨中藥被廣泛應(yīng)用于中醫(yī)骨科臨床，并對治療各種骨傷疾病有顯著療效，淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性成分，具有促進(jìn)骨細(xì)胞增殖與分化的功能[5]，是反映該制劑藥效的一個重要指標(biāo)；干膏量是藥效物質(zhì)的總和，是制劑發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，故本實(shí)驗(yàn)以淫羊藿苷含量及干膏量作為優(yōu)化水提工藝的指標(biāo)。

本方含19味中藥，成分復(fù)雜，曾對該制劑水煎液，干膏不同濃度的醇溶液進(jìn)行高效液相色譜測定條件摸索，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰較多，故采用聚酰胺進(jìn)行凈化處理，先用蒸餾水洗脫，除去雜質(zhì)，再用95%乙醇洗脫[6]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為本制劑的君藥淫羊藿的主要有效成分淫羊藿苷色譜峰明顯，且易于定量分析。

本研究先通過單因素試驗(yàn)確定骨疏寧口服液提取工藝各因素的因素范圍，再通過正交試驗(yàn)對其水提工藝進(jìn)行了優(yōu)化篩選，綜合評價了試驗(yàn)結(jié)果及方法的可行性，并進(jìn)行重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn)，最終確定了本制劑的最佳水提工藝為處方藥材分次加20(11+9)倍水，煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h。該提取工藝操作性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，為骨疏寧口服液的開發(fā)提供了依據(jù)。

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