兒童急性白血病骨髓單個核細胞中TAp63基因的表達及意義研究

潘陽瓊，陳豪，宋春蘭，成怡冰*

p63基因作為p53家族成員之一，定位于3號染色體長臂2區7帶（3q27～3q29），分布于皮膚、肌肉、乳腺、食管、肺、脾、淋巴細胞、神經組織、消化系統及泌尿生殖系統。p63基因的表達受兩種不同啟動子的調節而產生兩種具有不同活性的蛋白質，一種是全長鏈的活化型p63（TAp63），另一種是顯性失活的截短型p63（ΔNp63）［1］。潘陽瓊等［2］研究顯示，TAp63基因在成年人血液系統惡性腫瘤中表達增高，而這與TAp63基因在實體腫瘤中作用不同有關。為探索TAp63基因在兒童急性白血病發生、發展中的作用及其臨床意義，本研究采用半定量反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法，對兒童急性白血病初發、復發、化療后達完全緩解的患兒以及對照組骨髓單個核細胞中TAp63基因的表達進行了檢測。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2015年6月—2016年6月鄭州大學第三附屬醫院和鄭州兒童醫院兒科住院的初治或復發急性白血病患兒104例為急性白血病組，患兒均符合兒童急性白血病的診斷標準［3］，其中男64例，女40例；年齡1～12歲，中位年齡7歲；急性淋巴細胞白血病（ALL）80例〔急性B淋巴細胞白血病（B-ALL）61例，急性T淋巴細胞白血病（T-ALL）19例〕，急性非淋巴細胞白血病（ANLL）24例；初發患兒90例（高危型18例、低危型72例），復發患兒14例（均為高危型）。同期選擇鄭州大學第三附屬醫院和鄭州兒童醫院住院的非惡性血液病患兒36例作為對照組，其中男24例，女12例；年齡2～13歲，中位年齡8歲；包括傳染性單核細胞增多癥16例、免疫性血小板減少癥14例、缺鐵性貧血6例。

1.2 TAp63 mRNA檢測 所有患兒化療前采集骨髓標本2～4 ml，置于肝素抗凝管中，用Ficoll液分離骨髓單個核細胞，采用美國Gibco公司的TRIzol試劑盒，利用一步法提取總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書步驟進行，該試劑盒及說明書由北京康為世紀生物科技有限公司提供，反應體系20 μl，包括 5×RT Mix 4 μl，PrimerMix 2 μl，RNA Template 5 μl，HiFi-MMLV Mix 1 μl，RNase-free water 8 μl，37 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min后終止反應。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，TAp63上游引物5'-GGGTGAGCGTGTTATTGATG-3'，下 游 引 物5'-TTAGATGCCAGGTCAGATGTT-3'，擴增片段314 bp；內參照β-actin上游引物5'-TGAAGTGTGACGTGGACATCCG-3'，下游引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCCAG-3'， 擴 增 片 段449 bp。反應體系25 μl，包括cDNA 4 μl，上下游引物各 1 μl，2×Taq MasterMix 12.5 μl，其余以 RNasefree water補足至 25 μl，引物終濃度為 0.4 μmol/L。2×Taq MasterMix由北京康為世紀生物科技有限公司提供，PCR擴增條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，25個循環；72 ℃終延伸5 min。取PCR擴增產物5 μl上樣于2%瓊脂糖凝膠中電泳后觀察結果，以Gene tools from SynGene軟件進行掃描并測定其灰度值，以TAp63與β-actin PCR產物條帶灰度值的比值代表TAp63 mRNA相對表達量。TAp63 mRNA相對表達量＞0即為TAp63基因陽性表達。

1.3 治療方案 根據張之南等［3］主編的《血液病診斷及療效標準》（第3版）對所有急性白血病患兒行骨髓穿刺做骨髓形態學及細胞遺傳學檢查，根據檢查結果，將所有患兒分為低危型、中危型、高危型，其危險度分型標準相同。化療方案即誘導緩解方案：ALL患兒采用推薦兒童癌癥和白血病組（CCLG）-ALL 2008方案［4］，即VDLP方案（長春新堿、柔紅霉素、門冬酰胺酶、潑尼松）；ANLL患兒采用推薦方案［4］，低危型和中危型（除急性早幼粒細胞性白血病）：選DAE方案（柔紅霉素、阿糖胞苷、依托泊苷）；高危型：選IA方案（去甲柔紅霉素、阿糖胞苷）。臨床療效按照張之南等［3］主編的《血液病診斷及療效標準》（第3版）判定。

1.4 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學處理，計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher's確切概率法；計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TAp63基因在急性白血病組及對照組患兒中的表達 急性白血病組104例患兒中TAp63基因陽性表達86例，陽性表達率為82.7%，TAp63 mRNA相對表達量為（0.61±0.19）；對照組患兒TAp63基因陽性表達0例。

2.2 TAp63基因在ALL與ANLL患兒中的表達 ALL與ANLL患兒TAp63基因陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；ALL患兒TAp63 mRNA相對表達量較ANLL患兒升高，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

2.3 TAp63基因在初發與復發患兒中的表達 初發與復發患兒TAp63基因陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；復發患兒TAp63 mRNA相對表達量較初發患兒升高，差異有統計學意義（P＜0.05，見表2）。

2.4 TAp63基因在B-ALL與T-ALL患兒中的表達B-ALL患兒TAp63基因陽性表達率、TAp63 mRNA相對表達量較T-ALL患兒升高，差異均有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

2.5 TAp63基因在高危型與低危型初發患兒中的表達

高危型與低危型初發患兒TAp63基因陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；高危型初發患兒TAp63 mRNA相對表達量較低危型初發患兒升高，差異有統計學意義（P＜0.05，見表4）。

2.6 TAp63基因在完全緩解與未緩解患兒中的表達急性白血病組患兒中58例進行了系統治療，包括初發急性白血病患兒40例，復發急性白血病患兒18例。初發40例急性白血病患兒中，經誘導化療后達完全緩解30例（75.0%），未緩解10例（25.0%）；18例復發急性白血病患兒中達完全緩解6例，未緩解12例。完全緩解與未緩解患兒TAp63基因陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；未緩解患兒TAp63 mRNA相對表達量較完全緩解患兒升高，差異有統計學意義（P＜0.05，見表5）。

3 討論

人類p63基因定位于染色體3q27～3q29，在兩個不同的啟動子控制下，編碼兩類轉錄產物：一類為TAp63，另一類為ΔNp63，二者亞型結構不同，作用也不同，本研究探討的是具有轉錄激活區的TAp63，所設計的引物為TAp63α、TAp63β和TAp63γ共有的中間序列，以保證RT-PCR產物的特異性，使RT-PCR擴增產物為具有轉錄活性的TAp63，以與ΔNp63區別開。

表1 ALL與ANLL患兒TAp63基因陽性表達率及TAp63 mRNA相對表達量比較Table 1 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between ALL and ANLL children

表2 初發與復發患兒TAp63基因陽性表達率及TAp63 mRNA相對表達量比較Table 2 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between incipient and recurrent children

表3 B-ALL與T-ALL患兒TAp63基因陽性表達率及TAp63 mRNA相對表達量比較Table 3 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between B-ALL and T-ALL children

表4 高危型與低危型初發患兒TAp63基因陽性表達率及TAp63 mRNA相對表達量比較Table 4 Comparison of positive expression rate of TAp63 gene and TAp63 mRNA relative expression between high-risk and low-risk incipient children

現階段TAp63基因在腫瘤發生、發展中的作用尚不明確，相關研究發現可能有以下機制：（1）TAp63基因可影響細胞因子的水平，從而影響骨髓造血微環境，骨髓造血微環境的改變會影響腫瘤細胞的生存，如BINSKY等［5］發現在慢性淋巴細胞白血病（CLL）中通過自然配體刺激CD74從而上調TAp63基因的表達，TAp63基因表達水平升高可使得整合素極遲反應抗原（VLA-4）的表達水平升高，從而促進白血病細胞歸巢到骨髓，減少白血病細胞的凋亡，白血病細胞凋亡減少，又會促進白血病的發生。GRAZIANO等［6］研究提示TAp63基因在造血及淋巴系統惡性腫瘤中高表達，而在實體瘤低表達。ORZOL等［1］同樣認為TAp63基因在血液系統惡性腫瘤中高表達。HUMPHRIES等［7］研究表明TAp63基因在慢性粒細胞白血病（CML）及B細胞淋巴瘤中均高表達。TAp63基因同樣在濾泡性淋巴瘤（FL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）中高表達［8-11］。（2）研究發現在甲狀腺癌的發病機制中，TAp63基因可占據DNA中p53應答元件的結合位點，從而阻止具有更多轉錄活性的p53基因家族成員與其結合，提示在甲狀腺癌中TAp63基因通過抑制p53家族基因的功能而起到致癌基因的作用［12］。

急性白血病作為兒童惡性腫瘤，發病率較高，病死率更是占兒童惡性腫瘤的第一位，其發病機制復雜。LANTER等［13］研究發現：CD74激活核因子（NK）-κB家族，上調TAp63基因表達，其通過上調Bcl-2 mRNA進而上調Bcl-2蛋白質的表達，最終達到抗凋亡的作用，同時LANTER等［13］指出CD74/NK-κB/TAp63是一種細胞抗凋亡途徑。BINSKY等［5］發現：TAp63基因通過上調VLA-4基因的表達，同時與CD74共同抑制CLL細胞凋亡，并且促進其轉移至骨髓中，為白血病細胞提供生存環境。

本研究中急性白血病組患兒TAp63基因陽性表達率為82.7%，TAp63 mRNA相對表達量為（0.61±0.19）；對照組患兒TAp63基因陽性表達0例，提示TAp63基因可能在細胞生長周期中起到抑制凋亡作用，延長了腫瘤細胞的生存時間，使腫瘤細胞惡性增殖，兒童急性白血病的發生可能與TAp63基因的高表達有關。本研究顯示TAp63基因在ALL及ANLL患兒均有表達，同時ALL患兒TAp63 mRNA相對表達量較ANLL患兒升高，這與本課題組既往研究結果［2］一致。同時，本研究結果證明TAp63基因陽性表達率、TAp63 mRNA相對表達量尤其在B-ALL患兒中高表達，可能影響正常細胞的增殖及凋亡，并且參與了惡性腫瘤的發生、發展，這進一步提示TAp63基因在血液系統惡性腫瘤的發生與發展中扮演著致癌基因的角色，而不是抑癌基因的角色。

本研究結果顯示，復發患兒TAp63 mRNA相對表達量較初發患兒升高，高危型初發患兒TAp63 mRNA相對表達量較低危型初發患兒升高，說明TAp63 mRNA高表達是兒童急性白血病復發的高危因素。未緩解患兒TAp63 mRNA相對表達量較完全緩解患兒升高，同時經推薦化療方案治療后，復發患兒效果欠佳，緩解率低。TAp63 mRNA相對表達量高的患兒化療療效更差，在臨床治療前如果對急性白血病患兒進行TAp63 mRNA表達水平檢測，可能對其化療療效有一定的預測作用。TAp63基因的表達還與腫瘤的分化程度及預后相關。FUKUSHIMA等［14］發現，在FL中，TAp63基因陽性表達率隨著病理分級的增加而增加。左學蘭等［15］研究發現，在B細胞淋巴瘤中TAp63基因與凋亡指數（AI）和增殖指數（PI）呈正相關。

總之，TAp63基因可能通過促進增殖、抑制凋亡等途徑參與兒童急性白血病尤其是兒童B-ALL的發生、發展，并與預后相關。目前已經有一些促進凋亡及抑制細胞增殖的靶向治療藥物在臨床應用，對于兒童急性白血病的控制有一定療效，本研究旨在為兒童急性白血病的治療提供新的、更多的基因治療靶點，TAp63基因就可能作為兒童急性白血病新的治療靶點之一。

作者貢獻：潘陽瓊、陳豪進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，數據收集、整理，統計學處理，結果的分析與解釋，撰寫論文，進行論文的修訂；宋春蘭負責文章的質量控制及審校；成怡冰對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。

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