北京棒桿菌AS 1.299發酵生產蛋氨酸的營養條件優化

◎ 劉俊琦，于金龍，宋鳳亮

（1.吉林大學動物科學學院，吉林 長春 130000；

2.長春大成實業集團有限公司，吉林 長春 130000）

L-蛋氨酸（L-methionine）是一種含硫的氨基酸，是人體8種必需氨基酸中僅有的含硫氨基酸，與L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸共同屬于天冬氨酸的成員。蛋氨酸是含有1個氨基和1個羧基的中性氨基酸，小類又歸屬于非極性R基氨基酸。1個甲硫基（-SCH3）連接在C位碳原子上，因而也得名甲硫氨酸[1-3]。目前，天冬氨酸家族氨基酸除了L-蛋氨酸外，L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸在數年之前，就已經實現高產的發酵法生產。因此，學者對于研究蛋氨酸的高產發酵法非常熱衷。本文采用的出發菌株為北京棒桿菌AS 1.299。

微生物的生命活動都與周圍的生長環境息息相關，改變環境中的任何一個條件都會影響微生物的生命活動和生理狀態，因此，適宜的生長環境對于維持微生物生長或發酵產物生產的平穩或特需至關重要。本文對北京棒桿菌AS 1.299發酵產蛋氨酸的營養條件進行優化研究，確立最優的搖瓶產酸條件，以實現蛋氨酸的高產。

1 試驗材料與方法

1.1 菌種

北京棒桿菌AS 1.299，由實驗室篩選提供。

1.2 培養基[8]

完全培養基（C.M）配制方法：液體培養基含有0.3%牛肉膏、1%蛋白胨和0.5% NaCl，調節pH為7.0～7.2；固體培養基配制需在液體基礎上加1.5%營養瓊脂。

種子培養基（S.M）配制方法：0.5%酵母浸膏、2%蛋白胨和0.3%的尿素作為氮源，4%的葡萄糖作為碳源，鹽類含K2HPO4和MgSO4·7H2O，含量各為0.05%，KH2PO4含量為0.15%，調節pH為7.0～7.2。

發酵培養基（F.M）配制方法：含有0.4% (NH4)2SO4和0.1%的尿素作為氮源，4%的葡萄糖作為碳源，鹽類含KH2PO4和MgSO4·7H2O，含量各為0.05%，此外金屬鹽類含有 MnSO4·H2O 和 FeSO4·7H2O，含量各為0.02%，添加濃度為5 μg/100 mL的生物素以及濃度為200 μg/100 mL的硫胺素，調節pH為7.0～7.2；固體培養基需在此基礎上加2%瓊脂。

1.3 儀器

GTR10-2型高速冷凍立式離心機（北京時代北利離心機有限公司），HWS-250型恒溫恒濕培養箱（上海印溪儀器儀表有限公司），HY-4型往復式調速多用振蕩器（上海印溪儀器儀表有限公司），SW-CJ-2D（G）型凈化工作臺（上海印溪儀器儀表有限公司），AUY22O型分析天平（日本島津），LDZX系列智能型高壓蒸汽滅菌鍋（上海茸研儀器公司），大龍Dragon TopPette移液器，UV1700型紫外可見分光光度計（日本島津）。

1.4 試驗方法

1.4.1 蛋氨酸標準曲線的繪制[6]

對層析紙進行劃線處理，通常選上端1 cm處和下端2 cm處各畫一條直線，把蛋氨酸標準液配成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L和4.5 g/L共9個濃度，然后以相同的間距在層析紙下端直線上進行點樣，把含有樣品的層析紙置于層析液中，按照層析、干燥、顯色、洗脫的過程進行處理。然后把洗脫處理的樣品置于比色皿中，選取蒸餾水為對照，檢測波長512 nm下的吸光度值（OD）并構建坐標系，其中縱坐標為蛋氨酸含量，橫坐標為OD值，繪制蛋氨酸的標準曲線。

1.4.2 菌體濃度的測定[7]

把培養好的菌液稀釋相同的倍數，在660 nm波長下測定不同培養基中菌液的光密度值，光密度值越大，代表菌體濃度越大。

1.4.3 碳源的確定[8]

將發酵培養基置于三角瓶中，選一個無碳源的作為空白對照，分別需要三組平行。進行高壓蒸汽滅菌，冷卻后接種北京棒桿菌AS 1.299，接種量為8%，30 ℃搖床培養2 d（速度180 r/min），取離心后的發酵液中的上清液，測洗脫液的OD值，通過蛋氨酸標準曲線獲得相應蛋氨酸的產量，確定最佳碳源[9]；在此基礎上進行單因素試驗，配制碳源濃度分別為4%、6%、8%、10%、12%和14%的發酵培養基，確定碳源的最適濃度。

1.4.4 氮源的確定

將發酵培養基置于三角瓶中，其他操作同1.4.3，確定發酵產蛋氨酸的最佳氮源[10-11]，在此基礎上進行單因素試驗，配制氮源濃度分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%的發酵培養基，確定氮源的最適濃度。

1.4.5 金屬離子的確定

按1.2方法配制MgSO4·7H2O濃度為0.03%、0.05%、0.07%、0.09%和0.11%發酵液，然后分裝在3個三角瓶中，并且都做3個平行。以尿素為氮源，在121 ℃的條件下滅菌20 min，其他同上。

1.4.6 生物素濃度的確定

分別配制生物素濃度為1、3、5、7、9 μg/100 mL和11 μg/100 mL的發酵液，并且分裝在三角瓶中，且金屬離子MgSO4·7H2O的濃度確定為0.07%，其他同上。

1.4.7 營養條件的正交試驗

以單因素試驗結果為根據，正交優化設計各個單因素，見表1。

表1 L9（34）正交試驗因素水平設計表

2 結果與分析

2.1 蛋氨酸的標準曲線

蛋氨酸含量與OD值呈線性關系，如圖1所示。得到的回歸方程為Y=61.976X-0.169 1（Y表示蛋氨酸含量，X表示OD值），其相關系數為R2=0.996 9；說明蛋氨酸含量與OD值線性回歸比較顯著。

圖1 標準曲線圖

2.2 不同碳源及碳源濃度對菌體濃度和蛋氨酸產量的影響

從2圖中可以看出，以葡萄糖作為培養基的碳源對產生蛋氨酸和菌體生長最有利。而通過空白對照發現，缺乏碳源，不利于菌體生長，并且基本不產生蛋氨酸。圖3結果表明，蛋氨酸的產量在很大程度上受到葡萄糖濃度的影響，菌體的濃度和蛋氨酸的產量都是隨著葡萄糖濃度的增大而增大。菌體濃度和蛋氨酸產量在葡萄糖濃度為8%時達到最大值，隨著葡萄糖濃度的繼續增大，菌體濃度和蛋氨酸產量都有所下降。更深入的研究發現，當培養基中葡萄糖濃度達到一定高度值時，發酵液中的滲透壓就會升高，菌體細胞在高滲透環境中會滲出大量水分、電解質，影響菌體的生長，進而影響蛋氨酸的產量。由此可以得出，碳源是微生物菌體生長的必備營養條件，而葡萄糖與其他碳源相比較，效果最好。但是適宜的葡萄糖濃度對于菌體的生長和蛋氨酸的產量也是至關重要的，濃度過高或者過低都無法保證菌體的正常生長，這與國內外的大多數研究報道結果相符。

圖2 不同碳源對蛋氨酸產量和菌體濃度的影響圖

圖3 不同葡萄糖濃度對蛋氨酸產量和菌體濃度的影響圖

2.3 不同氮源及氮源濃度對菌體濃度和蛋氨酸產量的影響

不同氮源對蛋氨酸產量的影響如圖4所示。圖中結果表明，5種氮源中，尿素對菌體的生長和蛋氨酸的合成非常有利。其中，不加其他溶液，只把單獨的尿素作為氮源時，菌體的濃度和蛋氨酸的含量都達到了最高值。不同尿素濃度對菌體濃度和蛋氨酸產量的影響如圖5所示。當尿素濃度從0.3%增大到0.5%時，菌體濃度和蛋氨酸的產量隨著尿素濃度的增大而增加。當濃度達到0.5%時，菌體濃度和蛋氨酸產量達到最大值。但當尿素濃度繼續增大到1.1%時，菌體濃度和蛋氨酸產量反而出現了下降的趨勢。通過深入研究發現，當尿素的濃度達到一定值時就會抑制菌體的生長，進而導致蛋氨酸的產量下降。由此可以得出，氮源對微生物菌體生長至關重要，而且不同的氮源對菌體濃度與蛋氨酸產量的影響非常顯著，而尿素與其他氮源相比較，效果最好。但是適宜的尿素濃度對于菌體的生長和蛋氨酸的產量也是至關重要的，濃度過高或者過低都無法保證菌體的正常生長，這個結果也與國內外的大多數研究報道結果相符。

圖4 不同氮源對蛋氨酸產量和菌體濃度的影響圖

圖5 不同尿素濃度對蛋氨酸產量和菌體濃度的影響圖

2.4 不同濃度金屬離子對菌體濃度和蛋氨酸產量的影響

不同濃度MgSO4·7H2O對菌體濃度和蛋氨酸產量的影響如圖6所示。Mg2+是調節微生物生命活動的重要無機鹽離子，它是酶活性基團等的重要構成部分，對激活酶活性也起著重要作用，從而促進菌體生長。從圖中可知，菌體濃度和蛋氨酸產量隨著MgSO4·7H2O濃度的增大而增大，MgSO4·7H2O濃度為0.07%時，菌體濃度和蛋氨酸產量達到最大值，繼續增加MgSO4·7H2O濃度，菌體濃度和蛋氨酸產量都下降。此實驗結果表明，金屬離子是菌體生長和產蛋氨酸的必備條件，而且適宜的離子濃度才能獲得高產量的蛋氨酸，濃度過高或者過低都會影響相關酶的活性，進而影響菌體濃度以及蛋氨酸的產量。

圖6 不同金屬離子濃度對蛋氨酸產量和菌體濃度的影響圖

2.5 不同生物素濃度對菌體濃度和蛋氨酸產量的影響

圖7表明，不同生物素濃度對蛋氨酸產量的影響很明顯。從圖中的整體趨勢可以看出，過高或者過低的生物素濃度都會影響菌體濃度和蛋氨酸的產量，當生物素濃度低于5 μg/100 mL時，菌體濃度和蛋氨酸產量隨著生物素濃度增大而逐漸增多，當濃度達到5 μg/100 mL時，菌體濃度和蛋氨酸產量增加最多。當生物素濃度較高時，菌體濃度和蛋氨酸產量隨著其濃度的增加反而都有下降的趨勢。研究發現，生物素是菌體生長的一種重要生長因子，也是棒桿菌屬菌體發酵產蛋氨酸所必需的成分。而且，為了獲得高產量的蛋氨酸，生物素的濃度也要在合理的范圍內，超出一定的范圍，都會抑制菌體的生長進而影響蛋氨酸的產量。大量的國內外文獻研究表明，菌體的生長對生物素濃度的要求極高，要想獲得高產量的蛋氨酸，必須濃度適宜。

圖7 不同生物素濃度的作用圖

2.6 營養條件正交實驗結果分析

從表2中可以看出，碳源、氮源、金屬離子和生物素對蛋氨酸產量的影響大小為C>A>B>D，金屬離子的影響最大，其次是葡萄糖和尿素，影響最小的是生物素，最佳條件組合為A2B1C2D3，即葡萄糖8%、尿素0.6%、MgSO4·7H2O 0.07%、生物素 5 μg/100 mL，此條件下蛋氨酸產量為2.326 g/L。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表

3 結論

本文采用北京棒桿菌AS 1.299為出發菌株發酵生產蛋氨酸，研究了葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖以及無碳源對菌體濃度和蛋氨酸含量的影響，結果表明葡萄糖為最適宜碳源。研究了0.5%尿素、0.5%(NH4)2SO4、0.5%(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4和尿素比例4∶1、(NH4)2HPO4和尿素比例4∶1、(NH4)2SO4和(NH4)2HPO4比例1∶1作為氮源對對菌體濃度和蛋氨酸含量的影響，結果表明只有尿素為最適宜氮源。單因素的實驗結果表明，葡萄糖的最佳濃度為8%、尿素的最佳濃度為0.5%、MgSO4·7H2O的最佳濃度為0.07%、生物素的最佳濃度為5 μg/100 mL，在單因素實驗基礎上進行正交實驗設計，對蛋氨酸含量的影響順序是MgSO4·7H2O＞葡萄糖＞尿素＞生物素，最佳營養條件組合為葡萄糖8%、尿素 0.6%、MgSO4·7H2O 0.07%、生物素 5 μg/100 mL時蛋氨酸產量為2.326 g/L。

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