60 Coγ射線放射后大鼠腮腺細胞自噬初步觀察

藍鐵瓚 王代友 曹陽 楊亦萍 卿海云 曾祥林

巨自噬(macro-autophagy)，簡稱自噬，是細胞通過雙層膜狀結構包繞受損細胞器或大分子并將之運送到溶酶體加以降解利用的現象［1］。自噬與某些細胞放射敏感性密切相關［2－3］，與細胞凋亡相關。放射后唾液腺細胞大量凋亡［4－5］。對射線較為敏感的唾液腺的自噬情況以及自噬與凋亡關系，目前國內尚無文獻報道。本研究觀察放射前后大鼠腮腺細胞自噬、凋亡情況，檢測分析 Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3(microtubule associated protein 1 light chain3，LC3)表達，探討放射對腮腺細胞自噬的影響及放射后腮腺自噬與凋亡的關系，為研究唾液腺放射損傷的防治提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

60Co遠距離治療機(GWXJ80型，中國核動力研究設計院設備制造廠)，透射電鏡(Hitachi公司，H-7650型，日本)。正置熒光相差顯微鏡成像分析系統(OLYMPUS公司，日本)。Bax、Beclin1及LC3兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森);Bcl-2兔抗鼠多克隆抗體、通用型SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋);粉劑型酸性抗原修復液(福州邁新)。

1.2 動物分組

健康雄性SD大鼠54只(廣西醫科大學實驗動物中心)，10周齡，體重210～250 g。大鼠適應性飼養7 d，隨機分為9組，6只/組，對照組、6 Gy放射組及12 Gy放射組各3組。

1.3 腮腺放射損傷模型建立

頭頸部照射方式參照王代友等［4］方法。10%水合氯醛麻醉后，大鼠仰臥位固定，鎖骨之下用鉛塊遮擋，鎖骨以上部位暴露于射線。60Coγ射線放射源固定，射野約3.5 cm×5 cm，源皮距80 cm，放射中心在皮下10 mm，單次傳輸所需放射劑量，吸收劑量率為0.554 7 Gy/min。

1.4 標本采集備制

放射后12、24和48 h，麻醉后處死不同放射劑量組各一組。隨機取3只/組，60 s內，將右側腮腺切成約1 mm3組織塊，迅速放入預冷3%戊二醛溶液中固定，4℃保存3 h，按電鏡常規要求處理，制超薄片，染色，觀察。剩余腮腺在10%中性福爾馬林中室溫固定24 h，制備蠟塊。

1.5 目標蛋白檢測

蠟塊連續切片，厚度4μm，烤片，脫蠟，復水，修復液(pH 6.0)高壓修復。用免疫組織化學SABC法檢測。一抗為Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3兔抗鼠多克隆抗體(濃度分別1∶100、1∶100、1∶250、1∶250)。陽性對照標本為正常腮腺，以PBS液代替一抗行空白對照。其它步驟按試劑盒說明書進行。蘇木精復染，胞漿胞膜出現棕黃色為目標蛋白陽性信號。正置熒光相差顯微鏡成像分析系統觀察每張切片，在400倍光鏡下病理圖像分析系統(IPP軟件)按機械抽樣隨機選取5個視野，分析目標蛋白表達，表達強弱以平均吸光度值(A)表示。

1.6 透射電鏡觀察細胞凋亡、自噬

透射電鏡下，每標本隨機選取、觀察記錄25個非壞死細胞中凋亡細胞、自噬陽性細胞與自噬并凋亡細胞數量，計算自噬率與凋亡率。評判標準:胞漿中至少含1個自噬體或自噬溶酶體細胞為自噬陽性細胞;細胞核縮小、變形、染色質邊集、核周間隙增寬的細胞為凋亡細胞;1個細胞有自噬和凋亡特征時計為自噬陽性細胞、凋亡細胞。

1.7 統計學處理

數據用珋x±s表達，采用SPSS 16.0軟件包進行分析，方差齊性檢驗后，如方差齊，用單因素方差分析，樣本均數兩兩比較，用LSD-t檢驗，方差不齊，用非參數檢驗。P＜0.05，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腮腺細胞自噬與凋亡

透射電鏡下，對照組和放射組均見到自噬細胞和凋亡細胞。細胞中見到不同時期的自噬體及自噬溶酶體(圖1A～C)。部分正常細胞及凋亡細胞存在自噬溶酶體或自噬體(圖1D～F)。與相應時間對照組比較，各放射組細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，各放射組自噬陽性細胞所占比例無明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05)(圖1、表1)。

2.2 免疫組化染色結果

2.2.1 Bcl-2、Bax蛋白表達變化 與相應時間點對照組比較，放射后12、24和48 h，6 Gy放射組或12 Gy放射組Bcl-2蛋白表達均顯著下降，差異有統計學意義(P=0.003 和 0.010，0.006 和 0.000，0.002 和0.001，＜0.05)。

放射后12 h，與對照組比較，6 Gy放射組Bax蛋白表達差異無統計學意義(P＞0.05)，而12 Gy放射組Bax蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義(P=0.003，P ＜0.05)。放射后24和48 h，6 Gy放射組或12 Gy放射組Bax蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義(P=0.000 和0.002，0.004 和0.000，＜0.05)(表 2，圖 2)。

2.2.2 Beclin1、LC3蛋白表達 放射后12、24及48 h，與對照組比較，各放射組的Beclin1及LC3白蛋表達差異均無統計學意義(P＞0.05)(表3，圖2)。

3 討論

自噬消化降解細胞內大分子物質以及受損細胞器，在維護細胞內環境動態穩定方面起重要作用［6］，在自噬過程中，Beclin l分子及LC3分子起到重要作用。Beclin l是候選腫瘤抑制基因，LC3參與自噬膜的形成，是自噬形成的標志性因子。Bcl-2是凋亡抑制蛋白、Bax蛋白是促凋亡蛋白，水平變化可反應細胞凋亡的變化。目前，用透射電鏡觀察自噬和凋亡形態特征是檢驗細胞自噬和凋亡的可靠手段。

A:對照組自噬體(Ap);B:放射組早期自噬溶酶體(AL);C:放射組晚期AL;D:正常腮腺細胞;E:對照組凋亡細胞;F:放射組凋亡細胞(×20 000);AL:自噬溶酶體;ER:內質網;M:線粒體;N:細胞核;A～C:×50 000;D～F:×20 000圖1 透射電鏡下觀察腮腺細胞的自噬與凋亡A:Autophagosome(Ap)in control group;B:Early autolysosome(AL)in radiation group;C:Late AL in radiation group;D:Normal parotid gland cell;E:Apoptosis cell in control group;F:Apoptosis cell in radiation group;AL:Autophagolysosome;ER:Endoplasmic reticulum;M:Metochondria;N:Nucleus;A－C: ×50 000;D－F: ×20 000Fig 1 The autophagy and apoptosis of parotid gland cells observed by transmission electron microscope

表1 各組腮腺組織中細胞凋亡率及自噬陽性細胞在細胞中所占比例(珋x±s，n=3)Tab 1 The apoptosis rate and percentage of autophagy positive cells in parotid gland tissues of the groups(珋x±s，n=3)

本研究發現，與對照組相比，各放射組腮腺中自噬陽性率、Beclin1、LC3的表達水平均無明顯變化，結果與Maria等［7］報道單次5 Gy60Coγ射線放射后4～8 h腮腺自噬水平無明顯變化的結果相似，說明放射后12～48 h，單次6 Gy或12 Gy60Coγ射線對腮腺細胞自噬的影響可能是有限的。有研究表明放射后心肌細胞［8］和骨髓間充質干細胞［9］自噬水平均調高，自噬缺陷的腮腺細胞放射敏感性增加［7］。我們推測，腮腺細胞特性可能是放射后自噬水平無明顯變化的原因之一，放射后不能顯著提高自噬水平可能是腮腺放射敏感機制之一。

Maria等［7］認為放射后腮腺自噬與凋亡可能 相互抑制。本研究結果示放射組細胞凋亡率顯著增加，Bcl-2蛋白/Bax蛋白比值變小，差異有統計學意義，進一步證實放射誘導腮腺細胞凋亡，自噬無變化，結果不支持Maria等觀點，可能與放射劑量不同有關。放射后腮腺細胞同時存在自噬與凋亡現象，提示兩者之間可能存在某種關聯;唾液腺細胞是先自噬后凋亡［10］，

還是在損傷后先自噬以自救，當損傷超過自噬承受力時，自噬才誘導凋亡［11］，這有待進一步研究。

表2 Bcl-2、Bax蛋白在各組腮腺組織的表達(珋x±s，n=6)Tab 2 The expression of Bcl-2 and Bax protein in parotid gland tissues of the groups(珋x±s，n=6)

表3 Beclin1及LC3蛋白在各組腮腺組織中的表達(珋x±s，n=6)Tab 3 The expression of Beclin1 and LC3 protein in parotid gland tissues of the groups(珋x±s，n=6)

圖2 Bcl-2、Bax、Beclin1、LC3蛋白在腮腺組織中的表達 (免疫組化SABC，×400)Fig 2 The expression of Bcl-2，Bax，Beclin1 and LC3 protein in parotid gland tissues (IHC SABC，×400)

綜上述，60Coγ射線能激活腮腺細胞凋亡，但其對腮腺細胞自噬的影響可能是微弱的;放射后腮腺細胞的凋亡可能與自噬相關。

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