等離子體對基托樹脂表面白色念珠菌生物膜的殺滅研究

喬春元 馬小青 錢夢珂 謝海峰 張懷勤

近年來隨著乙肝、丙肝和艾滋病等的發病率增加，交叉感染已成為口腔醫學中亟待解決的問題。患者口腔唾液和血液可污染醫療器械和一些不易消毒的物品，如修復體、印模和石膏模型［1］，可摘義齒制作、調改、修理和重襯過程中，可造成交叉感染。義齒消毒常采用化學浸泡法，然而有報道化學消毒劑會導致義齒基托表面色澤改變、微孔形成和表面粗糙度增加［2－3］，并且對生物膜的滅活不夠充分［4］。低溫等離子體具有殺菌快速，高效，無化學殘留物，僅作用于材料表層對材料本體性能沒有影響等特點。前期已采用等離子體技術對印模表面乙肝病毒、石膏模型表面金黃色葡萄球菌進行殺滅研究，均取得良好效果。本研究比較氬氣、30%H2O2和50%H2O2等離子體對基托樹脂表面白色念珠菌生物膜的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

固化型義齒基托樹脂(日進中國昆山合資公司);國際標準菌株白色念珠菌(ATCC90028，南京便診生物科技有限公司);50%過氧化氫(南京康克化工有限公司);30%過氧化氫(國藥集團化學試劑有限公司);HPD－2400次大氣壓輝光放電低溫等離子體表面處理機(南京蘇曼電子有限公司);全自動菌落分析儀(Interscience，Scan200，法國);掃描電子顯微鏡(LEO，1530VP，德國)。

1.2 基托試件制備

按廠商說明使用基托樹脂制成9mm×9mm×2 mm的PMMA試件68塊，表面用600、800、1000目砂紙沿同一方向打磨，實驗前試件先蒸餾水清洗，后超聲振蕩20min，并在紫外光下正反面分別照射20min滅菌備用。

1.3 生物膜培養

將復蘇的白色念珠菌接種于沙堡培養基，于37℃恒溫培養箱中培養。連續傳2代后，取培養物于酵母浸出粉胨葡萄糖培養液(YeastExtractPeptoneDextrose，YPD)中增菌培養20h，將增菌產物離心(5000 r/min，4℃，5min)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。PBS重新懸浮，細菌比濁儀測定MCF(麥氏濁度單位)值為0.333，制備每毫升約含1.0×108菌落形成單位(CFU)的菌懸液。試件在PBS液中浸泡2h，放入24孔板，每孔加入2ml菌懸液，37℃培養2h，吸出菌懸液，每孔加入2mlYPD液，置于37℃培養箱內，每24h換液1次，培養48h后取出，用PBS漂洗2次。

1.4 等離子體處理

取64塊試件，隨機分為16組，每組4塊試件(n=4)。氬氣等離子體處理組共5組，用氬氣等離子體分別處理60、120、180、240、300s;30%H2O2等離子體處理組共5組，用30%H2O2等離子體分別處理20、40、60、80、100s;50%H2O2等離子體處理組共5組，用50%H2O2等離子體分別處理20、40、60、80、100s。輝光放電時電壓220V，電極距離55mm，電流1.5～1.8A。氬氣等離子體處理時，標本放于處理基臺上，用真空泵將氣壓調至1800～2000Pa后，通入氬氣(流量500ml/min)至大氣壓后，用真空泵再次調壓至1800～2000Pa，輝光放電。30%H2O2和50%H2O2等離子體處理時，將標本和1ml30%H2O2(或50%H2O2)溶液放于處理基臺上，真空泵調壓至1800～2000Pa，輝光放電。

1.5 洗脫計數

處理后的試件用2mlPBS液超聲震蕩清洗，取200μl菌液系列稀釋、涂板，37℃培養48h，全自動菌落分析儀計數菌落形成單位。取每組存活菌量平均值，評估3種等離子體對試件表面生物膜的殺菌效果。參考歐洲標準EN1275－2005，處理后真菌數量減少＞4log10CFU(即殺滅率＞99.99%)視為有效。殺滅率計算方法為:(對照組存活菌量－實驗組存活菌量)/對照組存活菌量×100%。

1.6 掃描電鏡分析

剩余4塊試件取1塊為對照組，其余3塊分別用氬氣、30%H2O2和50%H2O2等離子體處理300s，戊二醛固定、乙醇梯度脫水、冷凍干燥、噴金，掃描電鏡下觀察細胞形態。

2 結果

2.1 3種等離子體殺菌效果

30%H2O2等離子體處理 100s(表 1)、50%H2O2等離子體處理80s(表2)，對生物膜內白色念珠菌的殺滅(＞99.99%)即可達到歐洲標準的要求;而氬氣等離子體需處理300s(表3)才能有效殺滅白色念珠菌。

2.2 掃描電鏡分析

對照組(圖1A)生物膜內的白色念珠菌形態正常，菌體飽滿，表面平滑。氬氣等離子體處理300 s后(圖1B)，細胞膜完整性破壞，有孔洞。30%H2O2等離子體處理300 s后(圖1C)，細胞形態變化明顯，胞膜皺縮，表面粗糙。50%H2O2等離子體處理300 s后(圖1D)，細胞中央凹陷，周邊皺褶，孔洞增大，喪失正常形態。

表1 30%H2O2等離子體對白色念珠菌生物膜的殺菌效果(n=4)Tab1 Thefungicidalefficacyof30%H2O2plasmaagainstCandidaalbicansbiofilms (n=4)

表2 50%H2O2等離子體對白色念珠菌生物膜的殺菌效果(n=4)Tab2 Thefungicidalefficacyof50%H2O2plasmaagainstCandidaalbicansbiofilms (n=4)

表3 氬氣等離子體對白色念珠菌生物膜的殺菌效果 (n=4)Tab 3 The fungicidal efficacy of argon plasma against Candida albicans biofilms(n=4)

3 討論

A:對照組;B:氬氣等離子體處理300 s;C:30%H2O2等離子體處理300 s;D:50%H2O2等離子體處理300 s圖1 白色念珠菌生物膜掃描電鏡圖像 (×20 000)A:Control group;B:After 300 s of argon plasma treatment;C:After 300 s of 30%H2O2 plasma treatment;D:After 300 s of 50%H2O2 plasma treatmentFig 1 The SEM images of Candida albicans biofilms on the resin (×20 000)

可摘義齒使用后表面會形成生物膜，75%佩戴義齒患者的生物膜內會定植白色念珠菌［4］，近65%的患者罹患義齒性口炎，患者常訴有燒灼、味覺減退等不適感［5］。義齒性口炎影響患者的生活質量，經抗真菌治療后仍有很高的復發率［6］。國內外許多學者正在研究白色念珠菌與白斑發生及癌變的關系。有研究報道［7］白色念珠菌可能通過抑制NOD1信號通路減少白斑組織中人β－防御素的表達。多數微生物并非以浮游狀態方式生長，而是不同種屬的微生物分泌胞外基質促進細菌黏附、聚集［8］，共同定植于載體表面，形成高度組織化、系統化的生物膜(菌斑)。生物膜中的微生物對抗菌藥物的耐藥性可高達其在浮游狀態時的1 000 倍以上［5］。Théraud 等［9］比較了 6 種化學方法對白色念珠菌生物膜的殺滅效果，發現只有0.5%氯己定溶液能有效殺滅生物膜內白色念珠菌。但氯己定有致基因突變、過敏反應及神經毒性等副作用［10］。次氯酸鹽浸泡后，樹脂的撓曲強度降低，承受咬合力時義齒易折裂［11］。本實驗采用等離子體對樹脂表面白色念珠菌生物膜進行滅活研究，取得了較為滿意的結果。氬氣等離子體處理300 s，白色念珠菌數量減少＞4 log10CFU，殺滅率＞99.99%，達到歐洲標準的消毒要求。Matthes等［4］采用氬氣等離子體對基托表面的48 h白色念珠菌生物膜處理600 s后，對生物膜內白色念珠菌的殺滅為4.12 log10CFU，與本實驗的結果一致。而30%H2O2等離子體處理100 s、50%H2O2等離子體處理80 s，即可達到消毒的標準。在等離子體殺菌過程中，等離子體產生的活性成分起主要作用，如臭氧、原子氧、超氧根、羥基自由基、一氧化氮、過氧化氫等［12］。氬氣等離子體較30%H2O2和50%H2O2等離子體中的活性氧成分含量低，故相同處理時間，30%H2O2和50%H2O2等離子體的殺菌效果較氬氣等離子體強，Hury等［13］亦有類似報道。與浮游菌相比，同種菌的生物膜需要等離子體處理更長時間才能滅活［14］。隨著處理時間的延長，等離子體滲入并損傷具有復雜結構的胞外基質，產生類似酶降解的作用，從而破壞生物膜的三維結構［15］。生物膜喪失屏障作用后，生物膜內的細胞更易于殺滅［15］。等離子體中的活性氧成分蝕刻細胞壁，暴露并破壞細胞膜［12］。Kvam等［16］研究發現等離子體穿通細胞，導致細胞內容物釋放，繼而在細胞外發生DNA和蛋白質的損傷及細胞溶解。這與本研究SEM結果一致，圖像顯示等離子體處理后白色念珠菌細胞皺縮，出現孔洞、裂隙，完整性喪失。

本研究結果表明3種等離子體組均能有效殺滅樹脂表面生物膜內的白色念珠菌。30%H2O2和50%H2O2等離子體組的殺菌效果優于氬氣等離子體組。在以后的研究中將進一步采用等離子體對細菌、病毒等微生物進行實驗室及臨床殺滅研究。

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