新型膠原膜的研制及降解性能初探

鈕春子 程浩德 李宇 李德華

引導骨再生 (GBR)，是種植醫學上用以增加缺牙區骨量的重要技術，是口腔種植醫學發展過程中的里程碑。其成功的關鍵在于利用屏障膜隔絕外部的上皮和結締組織，穩定血凝塊，促進血管再生和成骨細胞的增殖，實現骨再生［1－2］。膠原膜作為一種可生物降解的屏障膜，因其良好的生物相容性、促進止血和傷口愈合，在臨床上應用廣泛［3－4］。不同的膠原原料種類、提取方法、加工成膜技術以及是否使用人工交聯等，都會影響膠原膜的性能［5－6］。人工交聯可以提高膠原膜的酶穩定性，增強膜的機械強度，但殘留的交聯劑通常具有細胞毒性，抑制組織愈合和血管化進程［7－8］。Bio-Gide膜是目前臨床上應用廣泛的非交聯膠原膜，大量研究證實了其在引導骨再生中促進缺損區成骨的可靠性，但其價格昂貴且降解速率偏快，有專家建議覆蓋雙層膜以增加其屏障時間。本實驗采用新的成膜技術，以牛皮來源的I型膠原為原料，利用溶劑揮發法研制一種新型膠原膜，以期延緩膠原的降解，延長膠原膜的屏障時間。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑

本實驗使用提取自牛皮的I型膠原，由常州藥物研究所提供;Tris-鹽酸緩沖液(TBS，北京雷根生物技術有限公司產品，批號0906A17);I型膠原酶(collagenase type I，C0130，Sigma-Aldrich，美國)。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 I型膠原膜的制備 將I型膠原溶于稀鹽酸，形成膠原混懸液，離心除去混懸液中的小分子和氣泡。將膠原勻漿置于真空干燥箱中梯度真空干燥，形成結構致密的I型膠原膜。包裝后環氧乙烷滅菌:溫度37℃、相對濕度40%，環氧乙烷濃度1 000 mg/L，滅菌3 h。常溫干燥環境下儲存備用。

1.2.2 I型膠原膜的形貌觀察及特征峰檢測 將I型膠原膜的表面、橫縱界面形成自然斷面，表面噴金、鉑，掃描電子顯微鏡 (HITACHI，S-3400N，日本)觀察其表面形貌;利用能譜儀 (EDAX-GENESIS，美國)分析其元素組成;采用傅里葉紅外光譜儀 (SHIMADZU，FTIR-8400S，日本)分析檢測膠原特征峰。

1.2.3 I型膠原膜的體外降解實驗 實驗組:I型膠原膜;對照組:Bio-Gide(BG)膠原膜;每組設3個重復樣。將實驗組和對照組的膜裁剪成5 mm×5 mm方形大小，分別置于1.5 ml離心管中，加入I型膠原酶溶液(1 mg/ml的 TBS溶液，含 0.005 mol/L CaCl2·2H2O)1 ml，于37℃恒溫箱中進行酶解反應。分別于10、40 min后取出膜，立即用去離子水潤洗3次，－80℃預凍24 h，－50℃真空凍干24 h。干燥后的膜表面噴金、鉑，掃描電鏡觀察膜的孔徑變化。

2 結果

2.1 I型膠原膜的形貌觀察及特征峰檢測結果

掃描電鏡示I型膠原膜表面平坦，結構致密，無明顯孔隙;放大可見膠原纖維典型的串珠樣結構，纖維與纖維間緊密排列形成較粗的纖維束，無其他雜質結構;斷面示膠原膜內部結構緊密，無明顯分層(圖1A～1D)。能譜分析示I型膠原膜的主要元素組成為C、O、N元素，第四處吸收峰為噴金、鉑后的鉑的吸收峰，無其余雜質成分(圖1E)。傅里葉紅外光譜分析示I型膠原膜、BG膠原膜上典型的膠原酰胺鍵吸收峰:3 400 cm－1附近(NH)、1 650 ～1 655 cm－1(C=O鍵)、1 480 ～1 600 cm－1(NH、CN)、1 200 ～1 360 cm－1(NH、CN)，紅色為BG膠原膜，藍色為I型膠原膜(圖 1F)。

2.2 I型膠原膜體外降解實驗結果

A～D:掃描電鏡圖(A:×100，B:×1000，C、D:×10 000);E:能譜分析圖;F:傅里葉紅外光譜分析圖圖1 I型膠原膜形貌結構及特征峰檢測圖A－D:SEM images(A: ×100，B:×1000，C，D: ×10 000);E:The energy spectrum analysis;F:Fourier infrared spectrum analysisFig 1 The structure and characteristic peak detection of the type I collagen membrane

圖2 I型膠原膜和BG膠原膜體外膠原酶降解后的孔隙變化圖Fig 2 The pore size changes of the type I collagen membrane and BG membrane after degradation in vitro

在體外I型膠原酶的作用下，I型膠原膜和BG膠原膜均逐漸降解。降解10 min時，I型膠原膜結構致密，未見明顯孔隙(圖2);BG膠原膜致密層出現直徑大于10μm的孔隙，且孔隙向其內部延伸(圖2)。降解40 min時，I型膠原膜結構仍較完整，可見部分直徑小于2μm的微小孔隙(圖2);而此時BG膠原膜進一步降解，致密層的結構明顯破壞，大的孔洞相互交通，膜的屏障作用顯著減弱(圖2)。該實驗結果提示:此I型膠原膜的孔徑變化明顯慢于BG膠原膜。

3 討論

GBR和GTR是基于成骨細胞和或牙周細胞增殖與分化的再生技術，利用屏障膜阻隔快速增殖的上皮和結締組織，為缺損區的成骨細胞或牙周組織提供一個相對穩定的再生環境。通常認為在GTR中需要4周才能實現牙周再生［3，9］;而成骨細胞需要4－6個月才能形成較成熟的新骨［10－11］。因此屏障膜應在上述時間內保持一定的完整性，才能真正發揮其屏障作用［12］。目前通常通過測量降解過程中膜的厚度、面積或質量的變化，來評價膜的降解程度［12－16］。膜剩余量的測量直觀、方便，但其并不能直接反應膜的屏障作用。屏障膜作用的本質應體現在其在缺損區成骨過程中發揮的阻攔作用，成纖維細胞的直徑約為10～15 μm，若在降解過程中若形成足夠大的、貫穿全層的孔洞，則剩余的膠原膜亦無法發揮完整的屏障作用。

傳統的凍干法制備的膠原膜具有較高的吸水膨脹率，且酶穩定性較差。本實驗采用溶劑揮發法制備的I型膠原膜，結構致密。以I型膠原酶作為體外降解酶檢測此膠原膜的酶穩定性［12，17－18］。降解 10 min 時 I型膠原膜表面未見明顯孔隙，而BG膜的致密層已經出現大量直徑大于10μm的孔隙;進行到40 min時，I型膠原膜表面出現少量直徑小于2μm的微小孔隙，而此時BG膜的致密層可見大的孔洞相互交通向膜的內部延伸。BG膜的結構相對疏松，纖維束之間存在一定空隙，這使得膠原酶在破壞其表面的同時易于向其深層滲透，表層和深層均受到破壞，屏障作用大大減弱。因此盡管BG膜仍有大量剩余，但相互貫通的孔洞和塌陷的纖維可能已經無法阻止成纖維細胞的侵入。而I型膠原膜以其均勻的致密結構延緩了膠原酶的降解和滲透，在觀察時間內仍保持完整的屏障作用。因此本實驗結果提示此I型膠原膜的屏障作用明顯強于BG膜。值得注意的是，體外降解實驗存在一定局限性，無法完全模擬在體環境，仍需后續進一步動物實驗檢測此I型膠原膜的屏障作用。

4 結論

本實驗通過溶劑揮發法制備結構致密的I型膠原膜，在體外膠原酶降解過程中呈較強的酶穩定性，屏障作用明顯增強，為膠原膜的研究提供一個新的實驗依據。

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