豬Beclin1基因調控偽狂犬病病毒誘導細胞自噬和凋亡的機制分析

胡 林，南良康，張 敏，許蘇童，楊了寒，李帥峰，王 凱，劉正飛，張淑君*(.華中農業大學動物科學技術學院，農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；.華中農業大學動物醫學院農業微生物學國家重點實驗室，武漢 430070)

偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)是α皰疹病毒亞科的重要成員，病毒粒子由囊膜蛋白、二十面體衣殼蛋白和線性雙鏈DNA組成，具有嗜神經性和潛伏感染的特點[1-2]。自然宿主有豬、羊和犬等。

細胞自噬可看作是一種特殊的細胞程序性死亡，以自噬體和自噬溶酶體的聚集為特征[3]。細胞自噬和細胞凋亡過程均由細胞內的調控網絡精確調節。其中，Bcl-2和Bcl-xL不僅能夠與BAX/BAK樣蛋白結合調節細胞凋亡，也可以與高度保守的自噬相關蛋白Beclin1互作而調控細胞自噬[4-5]。此外，Bcl-2能負調控PI3K/AKT信號和正調控mTOR信號通路從而抑制細胞自噬[6]，JNK信號通路通過誘導Bcl-2多個位點(Thr69、Ser70和Ser87)的磷酸化同時調控細胞自噬和凋亡[7]。研究表明，Beclin1能被Caspases切割，切割后的Beclin1喪失誘導細胞自噬的功能，但獲得促凋亡作用[8]。還原形式的HMGB1[9]、氧化形式的HMGB1[9]、ATG5[10]、被Caspase-3剪切的ATG4D[11]和Flice抑制蛋白[12]等都參與了細胞自噬或凋亡過程的調節。

細胞自噬是機體維持穩態和參與宿主對病原體反應的重要內在機制。研究表明,豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染MARC145會引起細胞自噬和凋亡，當自噬被抑制時病毒復制減弱，而凋亡被抑制時病毒復制加強[13]；PRRSV誘導細胞自噬，并且抑制自噬體和溶酶體的融合，從而有利于自身的復制[14]。進一步的研究結果表明，細胞自噬可以通過形成BAD/Beclin1復合物而推遲凋亡，促進PRRSV復制[15]。人巨細胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纖維細胞MRC5后，早期細胞自噬被激活，后期病毒抑制細胞自噬，病毒蛋白TRS1和IRS1能與Beclin1 互作調控細胞自噬，當細胞自噬增強時有利于病毒復制，相反抑制細胞自噬可減少病毒感染[16]，此外，HCMV感染人胚胎成纖維細胞后可通過激活mTOR信號通路顯著抑制自噬體的形成，以阻止感染期間誘導的細胞自噬的發生[17]。日本腦炎病毒(JEV)在病毒感染早期誘導細胞自噬，并且將病毒粒子轉運到自噬體用于病毒感染后續階段[18]。口蹄疫病毒(FMDV)能誘導細胞自噬從而促進自身的增殖[19]。細胞自噬可以降解細胞質成分并對水皰性口炎病毒(VSV)起到直接的抗病毒作用，且該抗病毒反應由PI3K/AKT信號通路控制[20]。單純皰疹病毒1型(HSV1)感染髓細胞BM-DCs可激活IFN基因誘導細胞自噬，偽狂犬病病毒(PRV)感染BM-DCs同樣可以激活BM-DCs自噬[21]。

PRV宿主較多、病毒株易重組和變異等特點給有效預防病毒的傳播和根除該病帶來了困難。細胞自噬對抵抗病毒侵襲或促進病毒增殖具有重要的調控作用，而其調控機制非常復雜。目前對人單皰疹病毒1型(HSV1)感染與細胞自噬相互作用機制的研究[22]較多，而對同樣屬于皰疹病毒科的PRV的相關研究較少。鑒于此，本研究以豬偽狂犬病毒(PRV)為對象，以宿主豬細胞PK-15為研究材料，研究PRV感染在宿主細胞自噬和凋亡中的作用，探討PRV感染過程中PRV誘導的細胞自噬和凋亡水平變化以及調控的途徑，分析Beclin1與豬宿主凋亡家族基因的相互作用、PRV誘導細胞自噬的可能性機制，以期闡明豬Beclin1基因在細胞自噬和凋亡中的調節作用，為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

偽狂犬病毒鄂a株(PRV-Ea)由農業微生物國家重點實驗室劉正飛老師提供。豬腎上皮細胞(porcine kidney-15 cell line，PK-15)為本實驗室保存。PK-15細胞呈貼壁生長，為梭形上皮細胞系，細胞間連接緊密，生長迅速，培養于37 ℃，5% CO2條件下；細胞培養基為高糖DMEM，添加10%胎牛血清。

1.2 主要試劑與儀器

細胞裂解液RIPA、苯甲基磺酰氟PMSF、Cocktail、磷酸酶抑制劑、SDS-PAGE蛋白質緩沖液(5×)和Protein A+G Agarose均購于碧云天生物技術公司。LC3A (NO4599P)、SQSTM1/P62(P0068)、Beclin1 (NO4122S)、Cleaved Caspase-9 (NO9509) 、Cleaved Caspase-8 (NO9496) 、Bcl-2 (NO4223) 和Bcl-xL (NO2764) 單克隆抗體購于CST公司。偽狂犬病病毒的衣殼蛋白抗體VP26由農業微生物學國家重點實驗室制備和饋贈。細胞凋亡檢測試劑盒AnnexinV-FITC購于凱基生物(KGA106)。

CFX96實時熒光定量PCR儀購于BioRad公司。蛋白免疫印跡轉移電泳儀JY-ZY5購于北京君意華鑫科技有限公司。ImageQuant LAS 4000化學發光成像分析儀購于通用醫療集團生命科學部。

1.3 熒光定量PCR

利用Thermo反轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA進行反轉錄，最后保存在-20 ℃。利用合成好的cDNA進行熒光定量PCR。在熒光定量PCR中，內參基因常被用來作為數據標準化的對照，用來校正模板cDNA存在的數量差異。良好的內參基因應該在不同實驗條件下或不同時間點上，在各個樣品中的表達都無差異，本試驗選擇GAPDH作為內參基因，定量引物及內參基因序列見表1。引物由上海生物工程技術服務有限公司和擎科生物合成。

表1基因qPCR引物

Table1PrimersofgenesforqPCR

基因Gene引物名稱Primername引物序列(5′→3′)Primersequences退火溫度/℃Tm擴增產物長度/bpSizeGAPDHF1GAAAGCCTGCCGGTGACTAA60274R1TGGAATTTGCCATGGGTGGABeclin1F1GGCGGCTCCTATTCCATCAA60108R1TGAGGACACCCAAGCAAGACBcl?2F1ATCAAGTGTTCCGCGTGACT60138R1GGGTACCAACAGCACCTCTCBcl?xLF1TGACCACCTAGAGCCTTGGA60174R1TTCCGACTGAAGAGCGAACC

利用熒光定量PCR儀反應，反應結束后分析數據。每個PCR反應設置3個重復，候選基因表達量按2-ΔΔCt計算方法對以上相關基因的表達水平進行相對定量分析。基因表達量數據由SPSS 16.0軟件進行方差和顯著性檢驗并作圖。

1.4 細胞免疫共沉淀

蛋白樣品的準備。對于100 mm細胞培養皿中的貼壁細胞，棄細胞培養液，PBS洗滌一次，然后加入1 mL RIPA裂解細胞；去除非特異性結合。取0.2～1 mL蛋白樣品，加入約1 μg和免疫沉淀使用的IgG種屬相同的普通IgG和20 μL充分重懸的Protein A+G Agarose，4 ℃緩慢搖動0.5～2 h。2 500 r·min-1離心5 min，取上清液用于免疫沉淀試驗；免疫沉淀。向上一步獲得的上清中加入0.2～2 μg用于免疫沉淀的第一抗體，4 ℃緩慢搖動過夜；再加入20 μL充分重懸的Protein A+G Agarose，4 ℃緩慢搖動1～3 h；2 500 r·min-1離心5 min，小心吸除上清；用PBS洗滌沉淀5次，加入20～40 μL 1×SDS-PAGE蛋白質緩沖液重懸沉淀，瞬時高速離心，將樣品離心于管底。沸水處理5 min，用于SDS-PAGE電泳。

1.5 免疫印跡

按20 μg的蛋白上樣量進行SDS-PAGE凝膠電泳，100 V恒壓轉膜1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入“1.2”所列的單克隆抗體， β-actin單克隆抗體(1∶3 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入抗兔或抗鼠的HPR標記二抗(1∶3 000)，室溫孵育2 h，洗膜后加入ECL顯色液，利用化學發光成像分析儀成像，并用ImageJ圖像分析軟件分析灰度值。

1.6 細胞凋亡檢測

收集細胞懸液，220 g離心后用含2%胎牛血清的1×PBS將細胞重懸，220 g離心10 min收集細胞，重復2次，每管中細胞量為5×105·mL-1；加500 μL Binding buffer 懸浮細胞；加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育5～15 min；在1 h 內，進行流式細胞儀的檢測激發波長Ex為488 nm；發射波長Em為530 nm的Annexin V-FITC綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測；PI紅色熒光通過PI通道(FL2或FL3)檢測，建議使用FL3；熒光補償調節：使用未經處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調節去除光譜重疊和設計十字門的位置；每次使用流式細胞儀進行檢測，必須使用未經凋亡試劑處理的正常細胞進行熒光補償調節，加入Annexin V-FITC單獨染色的正常細胞，加入PI染色的正常細胞與加入Annexin V-FITC和PI雙染的正常細胞作為對照進行檢測。

1.7 數據分析

2 結 果

2.1 PRV感染誘導LC3-Ⅱ表達上升、P62表達下降

細胞自噬過程中會伴隨著胞漿型LC3被酶切成LC3-Ⅰ，其與磷脂酰乙醇胺(PE)結合轉變為LC3-Ⅱ，因此LC3-Ⅱ表達水平的明顯增加是細胞自噬發生的標志。試驗結果表明，隨著PRV感染進程的推移，PRV衣殼蛋白VP26的表達量顯著升高，LC3-Ⅱ的表達水平明顯增加(圖1)。

***.P<0.001

圖1 PRV感染中PK-15細胞的自噬標志蛋白LC3-Ⅱ和病毒衣殼蛋白VP26的表達變化Fig.1 LC3-Ⅱand VP26 expression in PK-15 cells during PRV infection

自噬的標記蛋白除了LC3，SQSTM1/P62蛋白也同樣可以作為標記蛋白。SQSTM1/P62是一種涉及自噬的泛素化結合蛋白(P62)。偶聯于LC3的P62能夠在細胞自噬中晚期被自噬體降解[17]。在自噬過程中，P62表達水平與細胞自噬正相關；相反，自噬抑制劑可以穩定P62的水平。試驗結果表明，隨著PRV感染進程的推移，PRV衣殼蛋白VP26的表達量顯著升高，P62的表達量明顯的減少(圖2)。

***.P<0.001

圖2 PRV感染中PK-15細胞的自噬標志蛋白P62的表達變化Fig.2 P62 expression in PK-15 cells during PRV infection

2.2 PRV感染誘導的細胞自噬可能依賴于PI3K-Ⅰ/AKT通路

調控自噬的通路具體包括mTOR、AMPK、PI3K-Ⅰ/AKT和MAPK等通路。mTOR上游的PI3K-Ⅰ/AKT信號通路，可以激活mTOR。 AKT是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，細胞自噬受PI3K/AKT的控制，此途徑的激活能促進mTOR[20]。本試驗利用WB檢測了感染PRV后AKT和p-AKT(Ser473)蛋白表達水平。結果顯示，AKT蛋白表達水平無明顯變化(圖3A),而p-AKT的表達水平隨時間的延長而極顯著地下降(圖3B)。由此推測當PRV感染PK-15細胞后，通過下調p-AKT蛋白水平的表達，從而減少對mTOR的促進作用，從而誘導自噬的發生。這些結果表明PRV感染誘導自噬可能依賴于PI3K-Ⅰ/AKT通路。

A. WB檢測PRV刺激后PK-15細胞AKT表達不變；B. WB 檢測PRV刺激后PK-15細胞p-AKT表達下降； ***.P<0.001A. WB analysis of AKT expression in PK-15 cells unchanged before and after treatment PRV; B. WB analysis of p-AKT expression in PK-15 cells decreased after treatment PRV; ***. P<0.001

圖3 PRV感染PK-15細胞AKT和p-AKT蛋白表達水平Fig.3 AKT and p-AKT expression in PK-15 cells during PRV infection

2.3 PRV感染誘導細胞凋亡

Annexin V用來檢測細胞的早期凋亡水平。PI是一種利用細胞通透性區分早期和晚期凋亡的熒光染料。PRV處理12和24 h的凋亡情況相對于對照組，凋亡水平極顯著上升；處理24 h相對于12 h，早期凋亡相較于晚期凋亡明顯增加(圖4)。

2.4 PRV感染誘導細胞凋亡同時激活Caspase-9和Caspase-8蛋白

Pro-Caspase-9能被細胞質中APAF1和Caspase-9的結合激活，進而活化Caspase-3誘導細胞凋亡發生。死亡受體途經主要通過Cleaved Caspase-8調控，其不僅可以活化下游的效應Caspase-3，也可以通過剪切BID蛋白從而抑制BAK/BAX樣蛋白。WB檢測結果顯示，感染PRV的試驗組相較于對照組Cleaved Caspase-9的蛋白水平極顯著上升，在感染6 h時達到頂峰(圖5A)；同樣，Cleaved Caspase-8的蛋白水平也極顯著上升，在感染24 h時達到頂峰(圖5B)。

2.5 PRV感染抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL結合進而促進細胞自噬

Beclin1可以與VPS34、p150/VPS15、紫外線照射抗性相關基因(UVRAG)、ATG14樣蛋白(ATG 14L)和Rubicon蛋白結合，形成一個大的蛋白復合體。首先，檢測了Beclin1的mRNA和蛋白質水平，結果顯示PRV感染能夠刺激Beclin1的mRNA水平逐步上升，感染24 h前顯著上升(圖6A)，然后再下降。同時，12、24 h Beclin1在蛋白表達水平顯著增加(圖6B和C)。

本研究檢測了Bcl-2的mRNA和蛋白水平，結果顯示PRV感染能夠刺激Bcl-2的mRNA水平先上升后下降，感染6 h顯著上升然后逐漸下降，在36 h極顯著下降(圖7A)。同時，24 h前Bcl-2在蛋白水平上的表達隨著時間的改變極顯著上升(圖7B和C)。

本研究利用RT-qPCR檢測了Bcl-xL的mRNA水平，結果顯示PRV感染能夠刺激Bcl-xL的mRNA水平發生改變，24 h前極顯著上升，然后下降(圖8A)。同時，本研究利用WB檢測了Bcl-xL蛋白水平，24 h前Bcl-xL在蛋白水平上的表達呈現逐步上升的趨勢(圖8B和C)。

Bcl-2、Bcl-xL和Beclin1都含有BH3結構域，結合形成的抗自噬復合體Beclin1/Bcl-2和Beclin1/Bcl-xL，從而抑制Beclin1的促自噬作用[23]。因此，本研究通過免疫共沉淀試驗檢測感染PRV的PK-15 細胞中Beclin1與Bcl-2和Bcl-xL相互作用，結果顯示對照組和PRV處理組中Beclin1都能同Bcl-2和Bcl-xL結合，但是PRV感染試驗組相較對照組Beclin1與Bcl-2和Bcl-xL結合量明顯減弱(圖9)。說明PRV感染PK-15細胞后Beclin1能夠與Bcl-2、Bcl-xL結合，但是結合量減少，從而可能促進細胞自噬。

3 討 論

細胞自噬和凋亡是兩個進化過程中高度保守的生理過程，二者對生長發育至關重要，兩者失調則會破壞機體穩態。先前研究表明HSV1和PRV感染復數為3時感染BM-DCs早期(6 h)會導致細胞自噬[21]。English等[24]研究結果表明HSV1感染巨噬細胞細胞系誘導的細胞自噬不依賴PKR/eIF2α信號通路。因此，本研究旨在揭示PRV感染PK-15晚期是否同樣能誘導細胞自噬。

本研究首先揭示了PRV感染可以誘導細胞自噬。并利用細胞熒光觀察到細胞質中彌散性LC3以獨特的斑點狀重新分布的現象進一步說明PRV感染誘導細胞自噬。通過LC3-Ⅱ和P62蛋白表達量在PRV感染后的變化情況可初步推斷PRV感染PK-15誘導細胞自噬相較于BM-DCs出現的時間明顯晚一些。隨后，通過檢測p-AKT表達水平隨時間變化表明PRV感染PK-15誘導的細胞自噬可能依賴于PI3K/AKT信號通路。這與Shelly等[20]報道的VSV感染通過降低p-AKT磷酸化誘導細胞自噬的結果相一致。

***.P<0.001

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測的感染PRV的PK-15細胞凋亡水平上升Fig.4 Flow cytometry detection apoptosis of PK-15 cells enhanced by using Annexin V-FITC/PI staining

A. WB檢測PRV刺激的PK-15細胞不同時間Cleaved Caspase-9蛋白表達上升；B. WB檢測PRV刺激的PK-15細胞不同時間Cleaved Caspase-8蛋白表達上升；**.P<0.01；***.P<0.001A. WB analysis of Cleaved Caspase-9 expression in PK-15 cells increased after treatment PRV at all times investigated; B. WB analysis of Cleaved Capase-8 expression in PK-15 cells increased after treatment PRV at all times investigated; **.P<0.01；***.P<0.001

圖5 PRV感染的PK-15細胞Cleaved Caspase-9和Caspase-8蛋白表達水平上升Fig.5 Cleaved Caspase-9 and Cleaved Caspase-8 expression increased in PK-15 cells during PRV infection

A. RT-qPCR檢測PRV感染的PK-15細胞Beclin1的mRNA表達水平升高；B. WB檢測PRV感染的PK-15細胞Beclin1蛋白表達上升；C. Beclin1蛋白表達灰度分析結果；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001A. RT-qPCR analysis of Beclin1 mRNA level increased in PK-15 cells during PRV infection; B. WB analysis of Beclin1 expression increased in PK-15 cells during PRV infection; C. The grayscale analysis of Beclin1 protein; *.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

圖6 PRV感染PK-15細胞Beclin1的mRNA和蛋白水平變化Fig.6 Transcription and translation level of Beclin1 in PK-15 cells during PRV infection

A. RT-qPCR檢測PRV感染的PK-15細胞Bcl-2的mRNA表達水平升高；B. WB檢測PRV感染的PK-15細胞Bcl-2蛋白表達上升；C. Bcl-2蛋白表達灰度分析結果；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001A. RT-qPCR analysis of Bcl-2 mRNA level increased in PK-15 cells during PRV infection; B. WB analysis of Bcl-2 expression increased in PK-15 cells during PRV infection; C. The grayscale analysis of Bcl-2 protein; *.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001

圖7 PRV感染PK-15細胞Bcl-2的mRNA和蛋白水平變化Fig.7 Transcription and translation level of Bcl-2 in PK-15 cells during PRV infection

A. RT-qPCR檢測PRV感染的PK-15細胞Bcl-xL的mRNA表達水平升高；B. WB檢測PRV感染的PK-15細胞Bcl-xL蛋白表達上升；C. Bcl-xL蛋白表達灰度分析結果；***.P<0.001A. RT-qPCR analysis of Bcl-xL mRNA level increased in PK-15 cells during PRV infection; B. WB analysis of Bcl-xL expression increased in PK-15 cells during PRV infection; C. The grayscale analysis of Bcl-xL protein; ***. P<0.001

圖8 PRV感染PK-15細胞Bcl-xL的mRNA和蛋白水平變化Fig.8 Transcription and translation level of Bcl-xL in PK-15 cells during PRV infection

A. Beclin1與Bcl-2蛋白免疫共沉淀；B. Beclin1與Bcl-xL蛋白免疫共沉淀A. Co-IP analysis the interaction of Beclin1 and Bcl-2; B. Co-IP analysis the interaction of Beclin1 and Bcl-xL

圖9 PRV感染的PK-15細胞Beclin1與Bcl-2、Bcl-xL蛋白結合量減少Fig.9 Interaction of Beclin1/Bcl-2 and Beclin1/Bcl-xL decreased in PRV-infected PK-15

細胞自噬和凋亡雖然是兩種功能具有一定差異的生命活動，但二者卻存在著密切的關聯。用流式細胞術檢測了PRV感染PK-15細胞凋亡情況，說明感染PRV誘導PK-15細胞凋亡并且在感染12～24 h時間段內細胞發生早期凋亡和晚期凋亡的比率明顯升高，從而推測細胞自噬可能早于細胞凋亡發生。這與Zhou等[15]報道的PRRSV感染誘導的細胞自噬早于細胞凋亡的結果相似。同時，本研究還初步探討了PRV感染誘導的細胞凋亡依賴的細胞信號通路。常見的兩種細胞凋亡信號通路是涉及病毒復制并導致Caspase-9活化的細胞內在途徑和依賴于細胞表面可溶性死亡效應配體Caspase-8激活的細胞外途徑[25]。研究結果表明PRV感染誘導的細胞凋亡同時依賴于細胞內和細胞外兩個凋亡信號通路，在感染的早期主要依賴于細胞內途徑，在感染晚期主要依賴于細胞外途徑。推測PRV感染宿主細胞后集體為了抵抗病毒首先啟動的Bcl-2家族蛋白依賴的細胞凋亡通路，通過釋放細胞色素C活化Caspase-9；然后感染晚期，當Bcl-2家族信號減弱時，通過死亡受體通路激活Caspase-8，促進細胞凋亡釋放成熟的病毒粒子。

4 結 論

PRV感染誘導的細胞自噬可能依賴于PI3K-Ⅰ/AKT信號通路，PRV感染可能同時激活了線粒體凋亡途經和死亡受體途經從而誘導細胞凋亡，而PRV感染誘導的細胞自噬和細胞凋亡可能通過抑制Beclin1和Bcl-2、Bcl-xL結合而相互關聯。

參考文獻(References)：

[1] HUANG J, MA G J, FU L L, et al. Pseudorabies viral replication is inhibited by a novel target of miR-21[J].Virology, 2014, 456-457: 319-328.

[2] POMERANZ L E, REYNOLDS A E, HENGARTNER C J. Molecular biology of pseudorabies virus:Impact on neurovirology and veterinary medicine[J].MicrobiolMolBiolRev, 2005, 69(3):462-500.

[3] EDINGER A L,THOMPSON C B.Death by design:Apoptosis,necrosis and autophagy[J].CurrOpinCellBiol, 2004, 16(6):663-669.

[4] PATTINGRE S, TASSA A, QU X P, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy[J].Cell, 2005, 122(6):927-939.

[5] MAIURI M C, LE TOUMELIN G, CRIOLLO A, et al. Functional and physical interaction between Bcl-XLand a BH3-like domain in Beclin-1[J].EMBOJ, 2007, 26(10):2527-2539.

[7] HAM Y M, CHUN K H, CHOI J S, et al.SEK1-dependent JNK1 activation prolongs cell survival during G-Rh2-induced apoptosis[J].BiochemBiophysResCommun, 2003, 304(2):358-364.

[8] WIRAWAN E, VANDE WALLE L, KERSSE K, et al.Caspase-mediated cleavage of Beclin-1 inactivates Beclin-1-induced autophagy and enhances apoptosis by promoting the release of proapoptotic factors from mitochondria[J].CellDeathDis, 2010, 1:e18.

[9] TANG D L,KANG R,CHEH C W, et al. HMGB1 release and redox regulates autophagy and apoptosis in cancer cells[J].Oncogene, 2010, 29(38):5299-5310.

[10] YOUSEFI S, PEROZZO R, SCHMID I, et al.Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis[J].NatCellBiol, 2006, 8(10):1124-1132.

[11] BETIN V M S, LANE J D. Caspase cleavage of Atg4D stimulates GABARAP-L1 processing and triggers mitochondrial targeting and apoptosis[J].JCellSci, 2009, 122(14):2554-2566.

[12] LEE J S,LI Q L,LEE J Y,et al.FLIP-mediated autophagy regulation in cell death control[J].NatCellBiol,2009,11(11):1355-1362.

[13] LI S F, ZHOU A, WANG J X, et al.Interplay of autophagy and apoptosis during PRRSV infection of Marc145 cell[J].InfectGenetEvol, 2016, 39:51-54.

[14] SUN M X, HUANG L, WANG R, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus induces autophagy to promote virus replication[J].Autophagy, 2012, 8(10):1434-1447.

[15] ZHOU A, LI S F, KHAN F A, et al. Autophagy postpones apoptotic cell death in PRRSV infection through Bad-Beclin1 interaction[J].Virulence, 2016, 7(2):98-109.

[16] MOUNA L, HERNANDEZ E, BONTE D, et al. Analysis of the role of autophagy inhibition by two complementary human cytomegalovirus BECN1/Beclin 1-binding proteins[J].Autophagy, 2016,12(2):327-342.

[17] CHAUMORCEL M, SOUQURE S, PIERRON G, et al.Human cytomegalovirus controls a new autophagy-dependent cellular antiviral defense mechanism[J].Autophagy, 2008, 4(1):46-53.

[18] LI J K, LIANG J J, LIAO C L, et al. Autophagy is involved in the early step of Japanese encephalitis virus infection[J].MicrobesInfect, 2012, 14(2):159-168.

[19] O'DONNELL V, PACHECO J M, LAROCCO M, et al. Foot-and-mouth disease virus utilizes an autophagic pathway during viral replication[J].Virology, 2011, 410(1):142-150.

[20] SHELLY S, LUKINOVA N, BAMBINA S, et al. Autophagy is an essential component ofDrosophilaimmunity against vesicular stomatitis virus[J].Immunity, 2009, 30(4):588-598.

[21] RASMUSSEN S B, HORAN K A, HOLM C K, et al. Activation of autophagy by α-herpesviruses in myeloid cells is mediated by cytoplasmic viral DNA through a mechanism dependent on stimulator of IFN genes[J].JImmunol, 2011, 187(10):5268-5276.

[22] NAGELKERKE A, SWEEP F C G J, GEURTS-MOESPOT A, et al. Therapeutic targeting of autophagy in cancer. Part I: Molecular pathways controlling autophagy[J].SeminCancerBiol, 2015, 31:89-98.

[23] OBERSTEIN A, JEFFREY P D, SHI Y G. Crystal structure of the Bcl-XL-Beclin 1 peptide complex:Beclin 1 is a novel BH3-only protein[J].JBiolChem, 2007, 282(17):13123-13132.

[24] ENGLISH L, CHEMALI M, DURON J, et al. Autophagy enhances the presentation of endogenous viral antigens on MHC class I molecules during HSV-1 infection[J].NatImmunol, 2009, 10(5):480-487.

[25] JOUBERT P E, WERNEKE S W, DE LA CALLE C, et al. Chikungunya virus-induced autophagy delays caspase-dependent cell death[J].JExpMed, 2012, 209(5):1029-1047.