ANXA2與ERp29在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的表達與定位

高建鋒，李討討，陳燦燦，趙興緒,馬友記*(1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 70070；2.甘肅省肉羊繁育生物技術工程實驗室，民勤 700；.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 70070)

乳房炎是目前畜牧養殖業中最為常見的多發性疾病之一，會導致泌乳動物產奶量下降和乳成分及其理化性質等發生變化，從而降低乳制品的營養價值和經濟價值[1-4]。按泌乳動物有無乳房炎及病變的類型進行分類，將分為正常型、隱性乳房炎和臨床型乳房炎。正常型和隱性乳房炎在宏觀上用肉眼觀察，乳房與乳汁均無明顯異常，但在體細胞(somatic cell count, SCC)計數、細菌學檢測、乳汁導電率和pH上，二者結果明顯不同。臨床型乳房炎患者相比較前二者，在宏觀上，乳房和乳汁卻有著十分明顯的變化。其主要表現：1) 乳房紅腫、發癢、觸碰時有疼痛反應；2) 乳汁中含有絮狀物或呈水樣。乳房炎患者若不能得到及時治療，不僅會導致泌乳動物產奶量和奶品質顯著降低，而且還會影響正常生理功能，延長產后發情時間。因此，若能從這些病變的乳房炎患者中尋找更多的相關分子致病機理，將對早期診斷與治療具有重要意義。目前國內外學者和專家針對泌乳動物乳房炎病因、發病機理及致病原理等進行了大量的研究，但仍未找到安全有效的防治途徑。究其根源是由于正常乳腺組織產生炎癥反應會轉化為乳房炎，涉及多個致病基因、抑制基因、細胞黏附因子、生長因子及其多基因變異積累與相互作用。

本課題組前期結合二維電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)和質譜鑒定技術從正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中篩選與鑒定出差異性表達蛋白30種，其中ANXA2與ERp29蛋白在臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中分別被鑒定為下調蛋白和上調蛋白。ANXA2蛋白是一類受Ca2+所依賴的膜磷脂連接蛋白超家族成員之一[5-8]，在生物膜的形成、胞吞和胞吐、成骨細胞的形成和骨的重吸收、DNA合成、細胞增殖、凋亡及分化等方面起著重要調節作用。內質網蛋白29(ERp29)是一種新型的內質網應激蛋白，它不同于傳統的分子伴侶，既不與ATP結合也不與Ca2+結合[9-10]，但其主要發揮類似分子伴侶的功能，在新生蛋白的分泌和成熟中發揮著重要的作用。本研究以正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織為研究對象，應用qRT-PCR、Western blot和免疫組織化學法檢測ANXA2、ERp29 的mRNA和蛋白在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的表達與定位，旨在為進一步從分子水平上探討ANXA2與ERp29在綿羊乳房炎中的作用提供新的研究素材。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

正常與臨床型乳房炎綿羊(Ovisaries，各3只)乳腺組織樣品來源于甘肅省臨洮縣平長現代農牧業有限公司種羊場。其中患臨床型乳房炎綿羊可結合以下特征進行診斷:1)當肉眼觀測時發現綿羊乳房紅腫且觸摸時伴有堅硬疼痛、發熱等癥狀；2)擠掉初乳，再擠出乳汁置于滅菌的廣口瓶內，然后觀測綿羊乳汁的變化，當乳汁呈現絮狀和凝乳塊并且伴有一定酸臭味時，則最終判定為臨床型乳房炎。以正常綿羊為對照組。正常綿羊可通過pH法測定，當乳汁呈弱酸性時，則判定為正常。試驗羊經頸靜脈放血處死后，沿腹部正中線切開皮膚至恥骨后緣，剝離皮膚，用生理鹽水將避開脂肪組織的乳腺組織沖洗干凈，取約0.1 m3乳腺組織塊，剪成小塊，分裝于1.5 mL凍存管中后迅速投入液氮進行保存，之后轉入-80 ℃冰箱保存待用。將另一部分的乳腺組織固定在4%的多聚甲醛溶液中。

1.2 主要試劑

Trans Zol UP RNA提取試劑盒、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Ki、焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate, DEPC)水、Tran Start TipGreen qPCR Super Mix和Passive Reference Dye(北京全式金生物公司)；一抗(Rabbit Anti-ANXA2 antibody、Rabbit Anti-ERp29 antibody、Anti-beta-Actin)、免疫組化試劑盒(SP-0022)、二抗(Goat Anti-rabbit IgG/HRP)、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色試劑盒(北京的博奧森生物公司)；其他試劑均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取及反轉錄 將充分研磨好的綿羊乳腺組織根據Trans Zol UP RNA提取試劑盒的使用說明提取總RNA。選擇完整性較好的RNA樣品將其濃度調至500 ng·μL-1，按反轉錄試劑盒操作說明中的兩步法進行cDNA第一鏈的合成，將產物置于-20 ℃保存。

1.3.2 引物設計與合成 根據NCBI上已公布羊源膜聯蛋白 A2(ANXA2，NM_001093788.1)與內質網蛋白29(ERp29，EU596595.1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，NM_001190390.1)的序列，應用Oligo7軟件來實現對引物的設計，之后通過NCBI上的BLAST去檢測引物特異性，送上海生工生物公司合成。引物序列見表1。

表1qRT-PCR引物

Table1PrimersofqRT-PCR

基因Gene引物序列(5′→3′)Primersequence產物長度/bpProductslengthANXA2F：CAAGCCCCTGTATTTCGCTGA，R：CTTTCTGGTAGTCGCCCTT194ERp29F：CCTTCCCCTGGATACAATCACT，R：AGTTTTCAGCCAGACGCTTG125GAPDHF：GAAGGTCGGAGTGAACGGAT，R：GATGACGAGCTTCCCGTTCT196

1.3.3 qRT-PCR 以反轉錄得到的cDNA為模板，按照Trans Start?Tip Green qPCR Super Mix試劑盒建議的體系，對ANXA2、ERp29與GAPDH基因進行qRT-PCR擴增。反應體系(20 μL)：上下游引物(10 mol·L-1)各0.4 μL、cDNA 1 μL、2×Tran Start TipGreen qPCR Super Mix 10 μL、Passive Reference Dye(50×)0.4 μL、dd H2O 7.8 μL。擴增程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共 40個循環。所有樣品都做3次重復，待反應完成后，分別觀測熔解曲線和擴增曲線。

1.3.4 綿羊乳腺組織中ANXA2與ERp29蛋白表達水平的檢測 將苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)和裂解液加入到充分研磨的乳腺組織中，以此來提取乳腺組織中總蛋白，置于冰上充分裂解30 min，經4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，采用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicin choninic acid, BCA)試劑盒測定總蛋白的濃度，定量后按一定比例將4×SDS上樣緩沖液加入其中，并煮沸10 min，使蛋白變性，于-20 ℃保存。12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis, SDS-PAGE)，將蛋白從凝膠轉至聚偏二氟(polyvinylidenefluoride, PVDF)膜上，在室溫環境下使用濃度為5%的脫脂奶粉封閉存放2 h，分別向其中加入兔源ANXA2、ERp29一抗(1∶500)和鼠源β-actin一抗(1∶1 500)，并在4 ℃下孵育過夜。用含1%吐溫-20的pH 7.2的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗膜5次，將山羊抗兔二抗按照1∶5 000的比例加入其中。最后通過底物化學發光(electrochemi-luminescence, ECL)試劑盒完成顯影曝光，并記錄試驗結果。試驗重復3次。

1.3.5 乳腺組織免疫組織化學檢測 取石蠟切片，60 ℃烤片2.5 h。經常規方法脫蠟后按照免疫組化試劑盒的使用說明進行。滴加DAB顯色劑后觀測切片顯色反應，當顯色反應合適時，終止顯色。按照蘇木精二次染色、分化、脫水、透明、封片的順序進行后期處理并進行鏡檢照相。

2 結 果

2.1 綿羊乳腺組織中ANXA2與ERp29 mRNA的表達

應用實時熒光定量PCR，用內參基因GAPDH對正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的ANXA2與ERp29 mRNA表達量進行校正，結果表明：ANXA2與ERp29基因在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中均表達，且臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中ANXA2與ERp29 mRNA的表達量均極顯著高于對照組(P<0.01)(圖1)。

**.正常型 vs 臨床型 P<0.01。下同**.Normal vs Clinical P<0.01.The same as below

圖1 乳腺組織中ANXA2與ERp29 mRNA的相對表達量(n=6)Fig.1 The expression of ANXA2 and ERp29 mRNA in mammary gland tissue(n=6)

2.2 綿羊乳腺組織中ANXA2與ERp29蛋白的表達

運用Western blot檢測ANXA2、ERp29蛋白在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的表達，用內參β-actin對目的蛋白進行校正，結果顯示：ANXA2、ERp29蛋白在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中均有表達(圖2A)。在臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中，ANXA2蛋白表達量極顯著低于正常型(P<0.01)，ERp29蛋白表達量極顯著高于正常型(P<0.01)(圖2B,C)。

圖2 Western bolt檢測綿羊乳腺組織中ANXA2和ERp29蛋白表達(A)和相對表達量(B,C)Fig.2 The expression (A)and relative expression level(B,C)of ANXA2 and ERp29 proteins detected in mammary gland tissue of sheep by Western bolt

2.3 綿羊乳腺組織中ANXA2、ERp29蛋白表達與定位

免疫組織化學染色陽性產物呈黃褐色，表示有該蛋白的分布。從免疫組織的化學染色結果可以看出，ANXA2和ERp29在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中均有陽性反應，且主要定位于乳腺上皮細胞(圖3)。

3 討 論

膜聯蛋白超家族(annexins, ANX)是一類受鈣離子依賴、帶負電荷的膜磷脂結合的蛋白[11]。其中ANXA2屬于膜聯蛋白家族一員，廣泛存在于人體內多種細胞內[12]，具有多種生物學功能，如參與離子轉運、細胞增殖、分化、凋亡、信號轉導、細胞遷移、合成與結合等多個生物學過程[13-15]。目前有研究發現，ANXA2與多數腫瘤的發生、發展及轉移等過程密切相關[16-17]，且在不同腫瘤病變組織中差異性表達。如李鑫靜等[18]通過實時熒光PCR、Western blot技術及免疫組織化學發現，ANXA2在胃癌組織中的表達高于癌旁組織；于洋等[19]通過免疫組織化學方法發現ANXA2在口腔鱗癌組織中的表達明顯高于對照組；Zhang等[20]通過實時熒光PCR、Western blot技術、免疫組織化學染色及ELISA方法也發現ANXA2在肝癌組織中的表達明顯高于對照組，Li等[21]通過二維凝膠電泳和質譜鑒定技術發現ANXA2蛋白在食管鱗細胞癌中為下調蛋白。同樣本研究也探討ANXA2在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的表達，結果表明，臨床型乳房炎乳腺組織中該基因mRNA的表達明顯高于對照組，而該蛋白的表達卻明顯低于對照組，暗示ANXA2在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的轉錄與蛋白水平上的表達并不一致，其原因可能是由于基因表達在轉錄和翻譯階段存在時空間隔，這期間可能在mRNA達到峰值時蛋白還在增加，或蛋白達到峰值mRNA已經開始降解。但總體表明ANXA2在不同病變樣本組織中的表達模式不相同，這可能與研究對象，樣本量多少、不同治病機理與基因本身功能相關。

A1、A2.臨床型乳房炎與正常乳腺組織中ANXA2表達；B1、B2.臨床型乳房炎與正常乳腺組織中ERp29表達；C1、C2.臨床型乳房炎與正常乳腺組織的陰性對照；☆.乳腺上皮細胞A1,A2.Expression of ANXA2 in mammary gland tissues of normal and clinical mastitis; B1,B2. Expression of ERp29 in mammary gland tissues of normal and clinical mastitis; C1,C2.Negative control of mammary gland tissues of normal and clinical mastitis ; ☆.Mammary epithelial cells

圖3 免疫組織化學檢測乳腺組織中ANXA2與ERp29蛋白的表達Fig.3 The expression of ANXA2 and ERp29 proteins in mammary gland tissue by immunohistochemistry

內質網(endoplasmic reticulum, ER)存在于除哺乳動物成熟的紅細胞以外的各種真核細胞中，其主要功能是蛋白質的合成、修飾、加工和新生肽鏈的折疊、組裝與運輸，此外還具有合成脂質和排毒等功能。ERp29作為內質網上的一種蛋白，最初克隆于大鼠肝及牙釉質細胞[22-23]，廣泛表達于各種組織如甲狀腺、唾液腺、腎上腺、乳腺、前列腺、胰腺和肝等組織，但在心肌和骨骼肌中表達很少[24]。目前有研究表明，ERp29基因在組織或細胞中的差異性表達與多種疾病的發生密切相關[25]，如桑旭[26]通過免疫組織化學染色(immunohistochemistry, IHC)方法檢測ERp29在胃癌組織及癌旁組織中的表達，結果發現該蛋白在胃癌組織中的表達低于癌旁組織； Cheretis 等[27]通過免疫組織化學法也檢測ERp29在104例皮膚基底細胞癌患者(包括50個結節，29個浸潤，15個淺表，7個硬化，2個纖維上皮和1個色素細胞癌)中的表達，結果發現該蛋白在浸潤型癌中的表達較強，淺表癌中表達較弱；韓娉怡[28]也檢測ERp29在原發性肝癌與正常肝組織中的表達，結果發現ERp29在原發性肝癌中的表達明顯低于正常組。同樣本研究通過qRT-PCR、Western blot技術也檢測ERp29在正常與臨床型乳房炎乳腺組織中的表達，結果顯示，該基因在臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的mRNA與蛋白表達均明顯高于正常型。說明ERp29基因在不同病變組織中的表達具有差異性，暗示該蛋白與多種疾病發生與發展密切相關

可見，ANXA2、ERp29均在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的表達具有差異性，由此表明二者均參于泌乳動物乳房炎的發生與發展，但其作用機制不同，這可能與基因本身的功能相關。

4 結 論

ANXA2、ERp29 mRNA與其蛋白在正常與臨床型綿羊乳腺組織中均表達且表達趨勢存在差異。其中ANXA2在臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的mRNA表達明顯高于正常型，而該蛋白表達卻明顯低于正常型；ERp29 mRNA與蛋白在臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中的表達均明顯高于正常型；ANXA2和ERp29蛋白在正常與臨床型乳房炎綿羊乳腺組織中均有陽性反應且主要定位于乳腺上皮細胞。綜上表明，ANXA2與ERp29均參與綿羊乳房炎的發生與發展，但二者是否可以作為判斷乳房炎預后重要依據，還有待于進一步研究證實。

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