廣西HIV-1 B亞型假病毒的構建

黃春湲 王洪 梁浩 葉力 梁冰玉 蔣俊俊 陳榮鳳 寧傳藝廖艷研 余軍 黃頡剛

人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）具有很強的復制能力，能引起獲得性免疫缺陷綜合征，對全球的公共衛生來說是一個巨大的威脅［1］。隨著抗逆轉錄病毒藥物治療的廣泛應用，HIV耐藥性毒株也隨之增多［2］，甚至有些新感染患者攜帶的HIV病毒已經對目前獲批準抗逆轉錄病毒藥物產生耐藥性［3-4］。假病毒（pseudovirus）是指一種反轉錄病毒能夠整合另外一種不同種類病毒的囊膜糖蛋白，從而形成具有外源性病毒的囊膜，而基因組保持著反轉錄病毒本身基因組特性的病毒［5-6］，在耐藥檢測方面的優點逐漸突顯。隨著HIV假病毒相關研究的發展，有關我國HIV-1不同亞型的假病毒構建逐漸增多［7］。但目前國內針對HIV-1 B亞型構建假病毒的研究甚少，而關于廣西HIV-1 B亞型假病毒的構建尚未見有報道。廣西HIV-1 B亞型主要是泰國B亞型，與包括泰國、緬甸及云南德宏在內的B亞型毒株序列十分接近［8］。王茂鵬等［9］用于制備的HIV-1 B 亞型假病毒的包膜來源于HIV-1 B亞型病毒急性感染人類的血漿，且文中并未說明該假病毒在全國范圍的通用性。因此，本實驗預期構建針對廣西HIV-1 B亞型的假病毒系統。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、細胞 pNL4-3.Luc.R-.E-由廣西藥用植物園研究所吳無畏教授惠贈；pcDNA TM3.1（+）購自Invitrogen公司；pSV-EGFP質粒、293t細胞、TZM-bl細胞由本室自存；感受態細胞DH5α（TIANGEN）為用大腸桿菌DH5α菌株經特殊工藝處理得到的。

1.1.2 主要試劑 High Pure Viral RNA Kit高純度病毒RNA提取試劑盒購自瑞士Roche公司；Prime-ScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒、PrimeSTAR?MaxDNA Polymerase PCR擴增試劑盒、DNA純化試劑盒、T4 DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司；質粒小量提取試劑盒購自廣州欣研生物科技有限公司；GenJet轉染試劑購自美國Signagen公司；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；DMEM培養基購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 巢式PCR擴增和env基因片段的鑒定 用Roche High Pure Viral RNA Kit試劑盒從HIV-1 B亞型患者血漿樣本中提取病毒RNA。用Takara PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉錄試劑盒對RNA進行逆轉錄合成cDNA模板。用巢式PCR的方法擴增HIV-1env基因，引物序列：第一輪上游env1F：5′-TAGAGCCTTGGAAGCATCCAGGAAGTCAG-3′，下游env1R：5′-TAGCCCTTCCAGTCCCCCCTTTTCTTTTA-3′；第二輪上游env2F：5′-CCCAAGCTTGCCACCATGAGAGTGATGGAGATCAGG-3′，下游env2R：5′-CGGGATCCTTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGC-3′。為了進一步驗證病毒株為B亞型，參照文獻［10］，對HIV-1 pol區基因全長進行擴增及測序，對所獲得的pol序列采用MEGA 5.03軟件構建部分毒株Neighor-joining系統進化樹進行分型驗證。env區兩輪擴增體系為50 μL：25 μL PrimeSTAR?MaxDNA Polymerase（2×）、1.5 μL上游引物、1.5 μL下游引物、5 μL cDNA 模板/第一輪擴增產物，RNase Free ddH2O補足50 μL。兩輪擴增條件為：98℃10 s；55 ℃ 5 s，72 ℃ 2 min 30 s，35 cycles；72 ℃ 10 min，4℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產物。

1.2.2 pcDNA3.1-env重組質粒的構建 用HindⅢ、BamHⅠ分別雙酶切env基因片段和載體pcDNATM3.1（+），對所得反應液進行DNA純化并測定濃度后用T4 DNA連接酶進行連接。將重組載體轉化至感受態細胞DH5α中，鋪板、挑取單個生長的菌落進行培養。收集菌液采用質粒小量提取試劑盒進行pcDNA3.1-env重組質粒的小量提取并用Nano drop 2000測定所得質粒濃度，經雙酶切瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.2.3 pNL4-3.EGFP.E-R-重組骨架質粒的構建自行設計含有NotⅠ、XhoⅠ酶切位點的EGFP基因擴增引物，引物序列上游EGFP-F：5′-GCGGCCGCAATCGATGTACCGCGGGCCCGG-3′，下游 EGFPR：5′-CTCGAGTCTAGAGTCGCGGCCGCTCTTGTACAG-3′。采用PrimeSTAR?MaxDNA Polymerase進行擴增，反應程序為：98℃ 10 s；55℃ 5 s，72℃1 min，35 cycles；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。用NotⅠ、XhoⅠ分別雙酶切EGFP基因片段和骨架質粒pNL4-3.Luc.E-R-，然后進行DNA純化、轉化及重組質粒的擴增，并采用質粒小量提取試劑盒進行質粒提取，經雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 重組質粒外源性基因的表達驗證 （1）將獲得的pcDNA3.1-env質粒轉染至293t細胞。以24孔板為例：轉染前1 d以（2.0～3.0）× 105/孔種板，轉染前1 h給細胞換液，把稀釋后的pcDNA3.1-env質粒和稀釋后的GenJet轉染試劑進行混合，室溫孵育15～30 min后加入24孔板中，混勻；5～8 h后換液繼續培養48 h后棄上清，PBS清洗1次，加入RIPA裂解液反復吹打以收集細胞蛋白，離心取上層液；采用BCA法測定蛋白質濃度，蛋白定量后采用Western blot法檢測env基因表達，并使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統對條帶進行掃描，獲取圖像。（2）將獲得的重組骨架質粒pNL4-3.EGFP.E-R-轉染至293t細胞，轉染、培養方法步驟同上，最后采用熒光顯微鏡觀察細胞EGFP表達情況。

1.2.5 假病毒的獲得 將重組骨架質粒pNL4-3.EGFP.E-R-與重組包膜質粒pcDNA3.1-env共同轉染至293t細胞中：轉染前1 d以（2.0～ 3.0）×105/孔種板；轉染前1 h給細胞換液，把稀釋后的質粒DNA（骨架質粒與包膜質粒質量比為1∶2）和稀釋后的GenJet轉染試劑進行混合，室溫孵育15～30 min后移至24孔板中，混勻；5～8 h后換液繼續培養48 h后收集上清，假病毒即存在上清液中；用0.45 μm過濾器過濾后-80℃保存或進行感染實驗。

1.2.6 假病毒感染TZM-b1細胞 感染前1天將TZM-b1細胞以（8.0～10.0）×104/孔種于24孔板；感染前換液，每孔加入DMEM完全培養基300 μL，200 μL 假病毒液，5 μL 的 polybrene（1 μg/μL），置于37℃、5%CO2培養；48 h后通過熒光顯微鏡觀察EGFP表達情況。

2 結果

2.1 重組骨架質粒pNL4-3.EGFP.E-R-的鑒定及EGFP基因表達驗證 重組骨架質粒pNL4-3.EGFP.E-R-經雙酶切電泳驗證的結果見圖1，所得片段大小符合預期，約為740 bp左右。將獲得的重組骨架質粒轉染到293t細胞中，48 h后通過熒光顯微鏡觀察重組質粒EGFP表達情況見圖2，外源性EGFP基因成功克隆至重組骨架質粒中并能正常表達。

圖1 重組骨架質粒pNL4-3.EGFP.E-R-鑒定電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of recombinant plasmid pNL4-3.EGFP.E-R-

圖2 pNL4-3.EGFP.E-R-質粒轉染293t細胞熒光表達Fig.2 The fluorescent expression of 293t cells transfected with plasmid pNL4-3.EGFP.E-R-

2.2 重組pcDNA3.1-env質粒的獲得及鑒定

2.2.1env全長基因片段的獲得 部分樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3所示，在指示帶3 000 bp附近為擴增陽性樣本，即env基因片段。圖中顯示7份陽性擴增樣本，其中，17、20、23號樣本條帶單一且清晰，可直接用于克隆；8、16號條帶較弱，并出現非特異性擴增，需進行凝膠回收后方可進行克隆；2、9號條帶很弱，需稀釋后重新擴增以增加目的基因量。經HIV-1 pol區序列Genotyping初步分型和系統進化樹驗證，病毒為HIV-1 B亞型（圖4）。

圖3 HIV-1 env基因擴增電泳圖Fig.3 The electrophoretogram of HIV-1 env gene

圖4 廣西壯族自治區不同亞型HIV-1感染者基因序列的系統進化樹分析圖Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the gene sequences of HIV-1 infected individuals from different subtypes in Guangxi Zhuang Autonomous Region

2.2.2 重組pcDNA3.1-env質粒的獲得及鑒定 獲得重組pcDNA3.1-env質粒，經雙酶切、凝膠電泳鑒定陽性克隆。結果如圖5所示，以8號樣本為例，圖中5.5 kb左右條帶為載體pcDNA3.1條帶，3 kb左右條帶為克隆到載體中的env全長基因，共獲得4個陽性克隆，8-5為假陽性克隆。

圖5 pcDNA3.1-env重組質粒鑒定電泳圖Fig.5 The electrophoretogram of recombinant plasmid pcDNA3.1-env

2.2.3env蛋白的鑒定 通過Western blot驗證重組載體中env基因表達的正確性。如圖6所示，前4個泳道為陽性克隆轉染組，均表達gp160蛋白，即env蛋白；5號泳道為骨架質粒單轉染組（陰性對照），未見env蛋白表達。從HIV-1感染者血漿樣本中提取的病毒RNA，通過擴增并經電泳鑒定共獲得8份陽性擴增產物。分別將擴增產物克隆到pcDNATM3.1（+）中，每個樣本挑取5～10個克隆進行雙酶切驗證，共獲得10個陽性克隆。

圖6 Western blot檢測env基因重組質粒表達包膜蛋白Fig.6 Western blot detection of env gene expression from recombinant plasmids

2.3 攜帶EGFP基因的重組HIV-1假病毒具有單輪感染性活力 將克隆陽性的重組質粒pcDNA3.1-env與重組骨架質粒pNL4-3.EGFP.E-R-共同轉染到293t細胞，重組骨架質粒pNL4-3.EGFP.E-R-單轉染293t細胞作為對照，經48 h后收集細胞上清液。將收集的上清進行感染實驗，即把上清與TZM-b1共培養48 h后用熒光顯微鏡檢測熒光表達情況。結果如圖7所示，共轉染組上清與TZM-bl細胞共培養后可以觀察到熒光，骨架質粒單轉染組上清與TZM-bl細胞共培養后無熒光表達。同時，收集感染TZM-b1細胞48 h后上清并加入到新的TZM-b1細胞中進行第二輪感染，共培養48 h后用熒光顯微鏡觀察細胞中熒光表達，結果如圖8所示未見有熒光表達，表明獲得的重組假病毒只具有單輪感染性。

圖7 重組假病毒感染TZM-b1細胞48 h后熒光表達情況Fig.7 The fluorescent expression of TZM-b1 cells infected with recombinant pseudovirus at 48 h post-infection

圖8 TZM-b1細胞上清液第二輪感染TZM-b148h后熒光表達情況Fig.8 The fluorescent expression of TZM-b1 cells with second round infection by supernatant in TZM-b1 cell culture of first round infection at 48 h post-infection

3 討論

據文獻報道，廣西HIV-1患者耐藥發生率高于全國水平，不同亞型HIV-1流行株的耐藥發生率不同［11］，且鑒于耐藥性毒株對廣西艾滋病防控和治療的種種危害，提高對HIV-1耐藥性變化的關注尤為重要。目前，檢測HIV-1耐藥的方法主要是基因型耐藥性檢測及表型耐藥性檢測。基因型耐藥檢測僅能作為間接證據來評估樣本的耐藥性，在出現復雜組合耐藥位點時，其對耐藥性的判定未能考慮到耐藥位點間相互作用的效應［12］。表型耐藥檢測則能很好地克服基因型檢測的這些缺點，可以直接得出直觀的耐藥性數據，是目前檢測耐藥的金標準。但傳統的實驗方法耗時耗力，在分離病毒的過程中忽視了選擇效應的作用。而基于重組病毒技術的假病毒法表型檢測大大縮短了檢測時間，簡化了操作步驟，可以避免活病毒檢測法培養病毒時發生的基因突變，并且這種技術還可以和基因型耐藥檢測結果結合起來分析［13］。

針對不同亞型的毒株構建表型耐藥檢測假病毒有助于HIV-1患者的耐藥檢測。目前已有大量研究［7，9］針對我國HIV-1不同亞型毒株假病毒進行構建，而此前并沒有關于廣西HIV-1 B亞型假病毒構建的報道。廣西地區目前流行的HIV-1毒株有CRF01_AE、CRF08_BC、CRF07_BC、B亞型，B亞型占據了一定的比例［11，14］，較四川、貴州等地［15-16］的比例不同；而B亞型是歐美流行的優勢毒株，在20世紀80年代傳入我國云南靜脈吸毒人群，隨著時間的推移發生變異，并在我國廣泛流行開來。從地理位置來看，廣西流行的B亞型毒株，與包括泰國、緬甸及云南德宏在內的B亞型毒株間存在密切關系，流行時間短于云南而稍長于內地其他省［8］。鑒于廣西B亞型與我國其他地區B亞型有差異，本研究將HIV-1骨架載體pNL4-3.Luc.E-R-改造為攜帶EGFP基因的重組骨架質粒，并與自行構建的表達HIV-1 B亞型env基因的表達性pcDNA3.1-env重組質粒共轉染至293t細胞中成功獲得了具有單輪感染活性的假病毒。但是，這套系統對于表型耐藥檢測的實際應用尚需進一步驗證。

綜上，本研究成功構建了一種以EGFP為報告基團的廣西HIV-1 B亞型假病毒系統，具有單輪感染活性。可采用此系統進行人群隊列耐藥性監測，并同時結合基因型耐藥檢測的方法，綜合分析解釋廣西HIV-1 B亞型感染者耐藥性的演變，為制定更加科學合理的預防耐藥發生的干預措施提供理論依據，也為構建多種HIV-1基因亞型假病毒提供了參考。

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