GRIK3胞內(nèi)區(qū)蛋白在原核系統(tǒng)中的表達和純化

高永輝 肖斌 劉明 廖揚 唐榮芝 孫朝暉 李林海

中國人民解放軍廣州總醫(yī)院（廣州 510010）

谷氨酸是一種中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與機體多種重要的生理活動及病理改變。細胞膜表面的谷氨酸受體是游離谷氨酸發(fā)揮生物學(xué)功能的重要媒介［1-2］。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體，其中離子型谷氨酸受體又分為N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate receptors，NMDA）受體、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4異惡唑丙酸（α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoazolepropionic acid，AMPA）受體和紅藻氨酸受體（Kainate receptors，KARs）。離子型谷氨酸受體紅藻氨酸受體亞基3（glutamate ionotropic receptor kainate type subunit 3，GRIK3）是 KARs家族的 5種亞型（GRIK1、GRIK2、GRIK3、KA1、KA2）中的一員。研究表明GRIK1、GRIK2和GRIK3既可自身組合形成功能性的同質(zhì)性聚合體，也可彼此互相組裝形成有功能的異聚復(fù)合體［3-4］，兩者均在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用。目前有關(guān)GRIK3的大部分研究都集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能和作用機制已經(jīng)研究的較為詳盡［5］，但是關(guān)于GRIK3在其他系統(tǒng)和疾病中作用機制的研究卻非常有限。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，GRIK3在心臟、胰腺、肺等外周組織也有廣泛表達［6］，亦有報道稱，GRIK3在橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細胞瘤、甲狀腺腫瘤、肺癌、星形細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中均有高表達［7］。谷氨酸受體的過表達對于腫瘤微環(huán)境中具有高濃度谷氨酸的腫瘤組織的生長極為重要［8］，并可能影響腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能［9］。另外已證實NMDA受體家族能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生化代謝和增殖能力［10］。本課題組前期對GRIK3在乳腺癌中的生物學(xué)功能進行了初步探索，我們發(fā)現(xiàn)過表達GRIK3能夠促進乳腺癌細胞MCF-7的增殖與遷移，而敲低GRIK3顯著抑制乳腺癌細胞SK-BR-3的增殖與遷移（未發(fā)表）。為了深入研究GRIK3在腫瘤細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)機制，本課題組2017年3-11月擬篩選并鑒定GRIK3的直接相互作用蛋白。膜蛋白的胞內(nèi)區(qū)是與胞內(nèi)第二信使相互作用和介導(dǎo)蛋白構(gòu)象變化的重要區(qū)域。為此，我們需要獲得純化的GRIK3胞內(nèi)段蛋白并進行GST pull down實驗。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌種 Rosseta菌株、pCzn1質(zhì)粒、TOP10菌株均購自南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 Tyrptone、Yeast Extract購自 OXOID公司；IPTG、Acr、Bis、Tris購自Sigma公司；Agarose購自上海基因公司；限制性內(nèi)切酶NheI和XbaI購自TaKaRa公司；DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自AXYGEN公司；SDS購自Amresco公司；0.22 μm無菌濾器和透析袋購自Millipore公司；TEMED購自BIO-RAD公司；Protein Marker購自Thermo公司；Ni2+IDA親和層析膠購自Novagen公司；Pfu DNA聚合酶購自zoonbio公司，貨號PC12；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.3 儀器 AR5120電子天平（美國AHOM S公司）；Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini ProteanⅡ垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司）；320-S pH計（美國Mettler Toledo公司）；MultiTempⅢ恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀（美國Amersham Pharmacia公司）；PTC-200基因擴增儀（美國MJ Research公司）；雪花狀制冰機（日本SANYO公司）；臺式高速離心機（德國SORVAL公司）；JY92-2D超聲波細胞粉碎機（中國新芝科器研究所）；Allegra 21R臺式高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）；超凈工作臺（中國蘇凈集團）；NANODROP2000（Thermo公司）。

1.4 GRIK3表達區(qū)段的選擇及重組質(zhì)粒構(gòu)建按照 Uniprot網(wǎng)站（http：//www.uniprot.org/uniprot/Q13003）數(shù)據(jù)庫中對于GRIK3蛋白拓撲結(jié)構(gòu)的描述，選擇GRIK3胞內(nèi)區(qū)進行表達，GRIK3各區(qū)段截斷序列分布如圖1所示，胞內(nèi)區(qū)DNA序列由華大基因完成合成拼接（圖2）。

圖1 GRIK3蛋白的胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)及胞外區(qū)Fig.1 The intracellular regions，transmembrane regions and extraellular regions of GRIK3 protein

圖2 GRIK3蛋白的胞內(nèi)區(qū)拼接序列Fig.2 The splicing intracellular sequence of GRIK3 protein

使用限制性內(nèi)切酶NheI和XbaI分別對合成的DNA序列和pCzn1空載體進行雙酶切，然后把酶切后的DNA和線性化載體進行連接反應(yīng)，將獲得的重組質(zhì)粒pCzn1-GRIK3轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株后挑取陽性克隆進行測序，測序結(jié)果和原始序列對比無誤。

1.5 質(zhì)粒酶切鑒定 以限制性內(nèi)切酶NheI和XbaI對重組質(zhì)粒進行切割，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳來檢測pCzn1線性化載體和GRIK3胞內(nèi)區(qū)分子量的大小。

1.6 pCzn 1-GRIK3載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosseta把1 μL重組質(zhì)粒加入100 μL感受態(tài)細菌中，放置在冰上20 min；42℃熱激90 s后迅速放在冰中5 min；加入600 μL LB培養(yǎng)液，37℃，220 r/min振搖 1 h，離心后全部涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。

1.7IPTG誘導(dǎo)pCZN1-GRIK3載體融合蛋白的表達 挑取轉(zhuǎn)化平板上的單克隆接種在含50 μg/mL AMP的3 mL LB培養(yǎng)液的試管之中，37℃220 r/min振搖過夜；第2天按 1∶100接種于50 μg/mL AMP的30 mL LB培養(yǎng)液中，37℃220 r/min振搖菌體至OD600為0.6～0.8（大約 2 h）；取出1 mL培養(yǎng)物，室溫10 000g離心2 min，棄去上清液后用100 μL 1×上樣緩沖液使菌體沉淀重懸；向剩余的培養(yǎng)物中加入IPTG直到終濃度為0.5 mmol/L，對rosseta菌種37℃誘導(dǎo)4 h即可誘導(dǎo)融合蛋白表達；取出1 mL培養(yǎng)物，室溫10 000g離心2 min，棄去上清液后用100 μL 1×上樣緩沖液重懸菌體沉淀。重懸培養(yǎng)物4 000g離心10 min，棄去上清液，用PBS使菌體沉淀重懸；重懸液進行超聲波破碎后離心并分別取上清液與沉淀液加入上樣緩沖液重懸；進行12%SDS-PAGE分析。

1.8 融合蛋白的Ni柱親和純化 利用低壓層析系統(tǒng)，將上清液以0.5 mL/min流速上樣至已通過Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B親和層析柱；再用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 mL/min流速沖洗，至流出液的OD280值到達基線；用 Ni-IDA Washing-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/L 咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速沖洗，至流出液的OD280值到達基線；最后用 Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L 咪唑，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0）洗脫目的蛋白，流速為1 mL/min；收集流出液并加入透析袋中，使用 20 mmol/L Tris-HCl，0.10 mol/L NaCl，pH 8.0進行透析過夜；進行12%SDS-PAGE分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒酶切鑒定 瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，雙酶切后GRIK3胞內(nèi)區(qū)基因片段在500～750 bp之間，與目的基因的預(yù)期分子量大小相符。重組質(zhì)粒送華大基因測序后證實插入基因序列正確，無突變、缺失等情況。見圖3。

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達 將重組工程菌的誘導(dǎo)表達產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE分析，目的蛋白主要存在于上清中（圖4），目標條帶（含His標簽）的相對分子質(zhì)量約18 kD，大小與蛋白質(zhì)的理論分子量17.204 kD相符，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液表達產(chǎn)物在相同位置沒有明顯的目標條帶。

圖3 重組質(zhì)粒pCzn1-GRIK3的雙酶切鑒定Fig.3 The double enzyme digestion of the recombinant plasmid pCzn1-GRIK3

圖4 GRIK3蛋白胞內(nèi)區(qū)原核表達的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expressed GRIK3-intra

2.3 Ni柱純化結(jié)果分析 通過Ni柱親和純化目的蛋白GRIK3胞內(nèi)段，經(jīng)SDS-PAGE分析，洗脫液中可見清晰且單一的目標條帶（圖5），而未純化的透析液和流出液中除目標條帶以外，還含有明顯的雜帶，表明成功純化了GRIK3胞內(nèi)區(qū)。

3 討論

谷氨酸受體家族的各亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮重要作用，然而在其他惡性腫瘤中的生物學(xué)功能及作用機制仍有待發(fā)現(xiàn)。GRIK3是谷氨酸受體中的紅藻氨酸受體亞型成員之一。在腦組織中，紅藻氨酸受體參與突觸神經(jīng)信號傳遞的調(diào)節(jié)；GRIK3受體富集于海馬回突觸前部位，并通過紅藻氨酸受體促進突觸神經(jīng)傳遞。

近年來，多項研究表明紅藻氨酸受體在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起到關(guān)鍵作用。STEPULAK等［7］證實所有的谷氨酸受體亞單位在多種腫瘤細胞系中均有表達，且紅藻氨酸受體亞型表達水平較其他受體亞基更高。紅藻氨酸受體家族的各亞型蛋白，在特定腫瘤中發(fā)揮著不同的作用。LI等［11］利用全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）表明GRIK1是HBV引起的肝癌的易感性基因位點；WU等［12］發(fā)現(xiàn)GRIK2是胃癌的腫瘤抑制因子，在胃癌發(fā)生過程中，GRIK2的啟動子被甲基化而抑制GRIK2的基因轉(zhuǎn)錄，從而促進了胃癌的發(fā)展；PRADHAN等［13］證實GRIK3基因在肺腺癌的不同病理階段均被甲基化。基于以上研究，筆者認為GRIK3可能在腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。但GRIK3的相互作用蛋白和相關(guān)信號通路仍不清楚。另外，HUAN等［14］和LIU等［15］認為GRIK3通過神經(jīng)活性配體-受體途徑相互作用，并且與乳腺癌、結(jié)腸癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)；BAO等發(fā)現(xiàn)GRIK3的過度表達與淋巴瘤的轉(zhuǎn)移、YNM分期以及預(yù)后均相關(guān)，提示GRIK3是淋巴瘤的獨立預(yù)后因素。這些研究均表明GRIK3可能成為特定腫瘤的潛在檢測靶標，也提示GRIK3拮抗劑可能是未來治療特定腫瘤的有效手段。

圖5 GRIK3胞內(nèi)區(qū)蛋白純化后SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified GRIK3-intra

由于GRIK3為細胞膜蛋白，其分子量較大且蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，經(jīng)軟件預(yù)測含有大量的疏水性結(jié)構(gòu)，進行全長表達較為困難。而膜蛋白的胞內(nèi)區(qū)是傳遞胞外信號并激活胞內(nèi)第二信使的重要環(huán)節(jié)，是膜蛋白功能的重要執(zhí)行者。故本次實驗根據(jù)Uniprot網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中對于GRIK3蛋白拓撲結(jié)構(gòu)的描述，選擇GRIK3胞內(nèi)區(qū)進行表達。但是本實驗沒有對目的蛋白進行活性驗證，蛋白的活性是否受到影響這有待于后續(xù)實驗進行研究。

總之，本研究成功構(gòu)建出插入序列正確的GRIK3胞內(nèi)區(qū)原核表達質(zhì)粒pCZN1-GRIK3，在E.coli系統(tǒng)中高效表達并以Ni柱親和層析方式純化了目的蛋白，為探究膜蛋白GRIK3的相互作用蛋白及其下游信號通路、闡明GRIK3的生物學(xué)作用提供了有價值的研究工具。

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