吡非尼酮抑制轉化生長因子β1誘導的大鼠角膜基質細胞纖維化

吳共發 邱麗湞 黃綺亭 劉鈺君 曾宇婷 陳俊杰

1中山大學孫逸仙紀念醫院（廣州510120）；廣州市增城區人民醫院&中山大學孫逸仙紀念醫院增城院區 2病理科，3內三科，4眼科（廣州511300）；5廣西賀州光明眼科醫院（廣西賀州542800）

角膜的透明性直接決定光線能否良好通過眼球。角膜損傷后角膜基質容易過度纖維化甚至形成瘢痕而引起角膜盲。目前角膜盲是僅次于白內障的全球第二位致盲性眼病［1］。臨床上對于角膜瘢痕的防治仍十分棘手。吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是新型廣譜抗炎抗纖維化藥物，具有廣泛抗纖維化作用，已應用于臨床治療肺部纖維化等疾病［2-3］。人體不同器官或部位的纖維增生性疾病具有相同的致病機制，角膜瘢痕形成屬于眼表纖維增生性疾病范疇，所以認為PFD理論上具有防治角膜瘢痕的潛能。本課題組前期研究［4］發現PFD能明顯抑制大鼠角膜基質細胞的增殖能力，其機制可能與下調TGF-β1蛋白表達密切相關，在減輕角膜創傷愈合過程中的纖維化具有潛在的運用前景。本研究繼續進一步探討PFD抗角膜纖維化作用及可能機制，以期為臨床尋找安全有效的角膜瘢痕防治藥物。

1 材料與方法

1.1 材料 PFD粉末購自美國Selleck公司；DMEM培養基和胎牛血清為Gibco產品；重組人TGF-β1細胞因子購自美國Sigma公司；胰蛋白酶消化液、Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒、全細胞蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術研究所；小鼠單克隆Vimentin抗體、小鼠單克隆CollagenⅠ抗體、小鼠單克隆CollagenⅢ抗體、小鼠單克隆Keratocan抗體、小鼠單克隆CD90抗體購自英國abcam公司；檸檬酸鹽修復液、PBS粉劑、小鼠單克隆GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色劑購自中杉金橋公司。PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗細胞培養及鑒定 8～10周齡健康SPF級SD大鼠購自南方醫科大學實驗動物中心，雌雄不限，體質量150～220 g。大鼠處死后摘取眼球，顯微鑷撕去角膜上皮層和內皮層，將角膜基質層剪成4～5小塊，加入少量含10%FBS的DMEM培養液，置于37℃ 50 mL/L CO2條件的培養箱中孵育，24 h后進行補加培養液。原代細胞長滿80%左右后胰酶消化進行傳代培養。制作細胞爬片，應用免疫細胞化學法行Vimentin染色對細胞進行鑒定，操作按照說明書進行。所有實驗取第3～5代細胞進行。

1.2.2 細胞處理 細胞貼壁后換無血清DMEM作用24 h，使細胞同步化，然后細胞分為3組處理：（1）對照組：細胞給予含10%FBS的DMEM培養基；（2）TGF-β1組：對照組基礎上加入2 ng/mL TGF-β1；（3）PFD組：TGF-β1組基礎上加入1 mg/mL PFD處理。每組設置6個復孔，所有實驗組細胞處理48 h。

1.2.3 細胞增殖實驗 取對數生長期細胞以0.2×104個/孔數量均勻接種在96孔板，每孔終體積100 μL，細胞分組處理 48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8液，置細胞培養箱避光孵育2 h，酶聯免疫檢測儀于450 nm處測定每個孔的吸光度（OD值），計算6個復孔平均值。

1.2.4 Western blot 細胞分組處理48 h后，胰酶消化離心收集3組細胞，全細胞蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白質，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，操作均按照說明書進行。使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配制電泳所需的SDS-PAGE凝膠，每條凝膠泳道等質量40 μg蛋白上樣，將凝膠上的蛋白濕轉至PVDF膜，PVDF印跡膜加相應一抗4℃過夜孵育（CollagenⅠ釋度為1∶1 000、Collagen Ⅲ釋度為1∶600、Keratocan釋度為1∶500、CD90釋度為1∶250，GAPDH稀釋度為1∶1 000），辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG按1∶5 000稀釋使用，按照ECL反應檢測試劑盒說明書，將膜放在化學發光成像系統，采用ECL化學發光法進行圖像顯影，GAPDH為內參，顯像圖用Image J軟件進行分析讀取灰度值，相對蛋白表達量=灰度值目的蛋白/灰度值GAPDH。

1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料以±s表示，多組資料的比較進行方差齊性檢驗和單向因素方差分析，方差齊則多重比較采用LSD法檢驗，方差不齊則多重比較采用Dunnett T3法檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態與鑒定 原代培養的大鼠角膜基質細胞呈圓形或多角形，胞體有絲狀突觸伸出，呈樹枝狀或骨針樣。細胞貼壁后體積變大，突觸有所變短，排列紊亂。免疫細胞化學行Vimentin染色鑒定，顯示大鼠角膜基質細胞陽性表達Vimentin，胞漿呈棕黃色（圖1）。

圖1 大鼠角膜基質細胞胞漿呈Vimentin陽性表達Fig.1 The cytoplasm of rat corneal stromal cells were positive for Vimentin

2.2 細胞增殖能力變化情況 CCK-8檢測顯示對照組、TGF-β1組和PFD組OD值分別（0.855±0.565）、（1.531 ± 0.833）和（0.421 ± 0.384），差異具有統計學意義（F=484.68，P=0.000）。多重比較顯示TGF-β1組OD值均高于對照組和PFD組（P=0.000）；相比對照組和TGF-β1組，PFD組OD值最低（P=0.000）。

2.3 CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、Keratocan和CD90蛋白的表達情況 以GAPDH為內參，PFD組的CollagenⅠ和Keratocan蛋白表達量明顯高于對照組和TGF-β1組，兩個蛋白均以TGF-β1組表達最低；PFD組的CollagenⅢ和CD90蛋白表達量明顯低于對照組和TGF-β1組，兩個蛋白均以TGF-β1組表達最高（圖2）。統計分析各蛋白條帶圖的灰度值計算蛋白相對表達量，發現3組間的4個蛋白相對表達量差異均有統計學意義，其中CollagenⅠ和Keratocan蛋白表達量以PFD組最高，TGF-β1組最低（P＜0.05），CollagenⅢ和CD90蛋白表達量以PFD組最低，TGF-β1組最高（P＜0.05，表1）。

圖2 各組CollagenⅠ、CollagenⅢ、Keratocan和CD90蛋白表達變化情況Fig.2 The expression of CollagenⅠ，CollagenⅢ，Keratocan and CD90 protein in each group

表1 各組CollagenⅠ、CollagenⅢ、Keratocan和CD90蛋白相對表達量比較Tab.1 The relative quantitative expression of CollagenⅠ，CollagenⅢ，Keratocan and CD90 protein were compared amog the groups ±s

表1 各組CollagenⅠ、CollagenⅢ、Keratocan和CD90蛋白相對表達量比較Tab.1 The relative quantitative expression of CollagenⅠ，CollagenⅢ，Keratocan and CD90 protein were compared amog the groups ±s

組別對照組TGF-β1組PFD組F值P值CollagenⅠ0.184±0.304 0.066±0.011 0.571±0.045 206.327 0.000 CollagenⅢ0.681±0.039 0.856±0.046 0.347±0.048 101.706 0.000 Keratocan 0.042±0.005 0.003±0.001 0.163±0.014 285.816 0.000 CD90 0.265±0.068 0.570±0.043 0.094±0.010 80.715 0.000

2.4 CollagenⅢ和CollagenⅠ比值 根據CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白相對表達量，計算CollagenⅢ/CollagenⅠ比值，對照組、TGF-β1組和PFD組的CollagenⅢ/CollagenⅠ比值分別為3.757±0.609、13.192±2.233和0.612±0.104，以TGF-β1組的比值最高，PFD組比值最低（F=71.856，P=0.000）。

3 討論

角膜損傷深達Bowman膜以下時，初期由角膜上皮細胞向下修復，后期由角膜基質細胞分泌膠原或成纖維細胞填充，愈合后往往形成瘢痕導致角膜混濁［5］。TGF-β被證實是角膜創傷修復最重要的細胞因子，也是導致角膜纖維化的主要調控細胞因子［6］，在TGF-β的亞型中以TGF-β1的調控作用最顯著。過度TGF-β1具有延遲角膜上皮細胞再生、促進角膜基質細胞增生、激活靜止的基質細胞向成纖維細胞及肌成纖維細胞轉分化的作用，導致細胞外基質異常增多及沉積等多種生物學效應［7］。PFD的抗纖維化機制之一就是抑制TGF-β的過度表達。目前PFD在角膜瘢痕方面的研究報道不多。國外CHOWDHURY等［8］和FINK等［9］報道PFD能通過抑制TGF-β來減輕角膜化學性燒傷導致的角膜基質纖維化，抑制角膜瘢痕形成，但目前PFD抑制角膜纖維化的分子機制尚未闡明。

本課題組前期研究［4］發現PFD具有減輕角膜纖維化的潛能。已知TGF-β1能刺激角膜基質細胞出現纖維化表型［10］，據此本研究在大鼠角膜基質細胞中加入TGF-β1，觀察PFD對TGF-β1的拮抗作用，以探討PFD抗角膜瘢痕的可能機制及作用。結果顯示TGF-β1能促角膜基質細胞增殖，而PFD能抑制這種促細胞增殖作用。TGF-β能促進成纖維細胞活化增殖，從而發揮致纖維化作用，是公認的最強有力的促纖維化細胞因子之一［11］。研究證實PFD治療肺纖維化疾病的主要機制就是通過抑制TGF-β途徑實現的［12］。結合本研究中PFD能拮抗TGF-β1對角膜基質細胞的活化增殖作用，筆者推測PFD是抑制角膜纖維化的較有效潛在藥物。

正常角膜基質中CollagenⅢ極少，CollagenⅠ占80%以上，故CollagenⅢ/CollagenⅠ比值很小，角膜瘢痕形成時會產生過多的CollagenⅢ，此時細胞外基質以CollagenⅢ為主［13］，導致CollagenⅢ/CollagenⅠ比值增大，是病理性纖維化形成的標志之一。本研究進一步檢測發現PFD能增強大鼠角膜基質細胞的CollagenⅠ表達而減弱CollagenⅢ表達，CollagenⅢ/CollagenⅠ比值以PFD組最低，TGF-β1組最高，證實TGF-β1能誘導角膜基質細胞纖維化的出現，而PFD能逆轉TGF-β1誘導的角膜基質細胞纖維化。Keratocan被視為角膜基質細胞的標記物［14］，在基質細胞轉化為成纖維細胞中表達明顯減低［15］。CD90被證實在角膜基質成纖維細胞中高表達，在基質細胞纖維化過程中表達增加［16］，正常角膜基質細胞中基本不表達［17］，可以作為區分角膜基質細胞和基質成纖維細胞的可靠標記。本研究中PFD能增強角膜基質細胞的Keratocan表達和減弱CD90表達，提示PFD抑制TGF-β1誘導的纖維化，維持了正常角膜基質細胞表型。

綜上所述，TGF-β1能刺激角膜基質細胞出現纖維化表型，而PFD能抑制TGF-β1誘導的角膜基質細胞纖維化表型，表現為細胞增殖受到抑制，CollagenⅠ和Keratocan表達增強而CollagenⅢ和CD90減弱，CollagenⅢ/CollagenⅠ比值增大。TGF-β作為公認的最強有力的促纖維化細胞因子之一，筆者推測PFD抗角膜基質細胞纖維化是通過抑制TGF-β分子途徑，從而影響膠原合成和Keratocan、CD90蛋白表達實現的。本研究在前期基礎上進一步驗證了PFD能抑制TGF-β1誘導的大鼠角膜基質細胞纖維化的能力，有望成為治療角膜纖維化及瘢痕的新手段。由于纖維增殖性疾病發生機制還涉及除TGF-β以外的其他多種致炎致纖維化因子，所以PFD抑制角膜纖維化的作用及機制尚待深入研究。

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