云南省彝族人群SRD5A2基因多態性與前列腺癌的相關性

羅鈺輝 李康健 官潤云 申吉泓 劉孝東 李顥

昆明醫科大學第一附屬醫院（昆明 650032）

前列腺癌是全球范圍內男性最常見的惡性腫瘤，2015年有160萬前列腺癌患者被確診，366 000人死于該病［1］。近年來，前列腺癌發病率在我國呈現逐年上升趨勢［2］。但是目前前列腺癌的病因尚不明確，基因和環境是其危險因素［3］。由于雄激素在前列腺癌的發生、進展中起到了非常重要的作用［4］，而睪酮5-α還原酶Ⅱ（testosterone 5-alpha-reductaseⅡ，SRD5A2）基因編碼的睪酮5-α還原酶Ⅱ是雄激素合成過程中睪酮轉化為雙氫睪酮的關鍵酶［5］，所以SRD5A2基因多態性與前列腺癌易感性的關系受到人們的廣泛關注。但是，SRD5A2基因多態性與前列腺癌的相關性研究大多集中于歐美人群，僅有少量中國漢族人群的研究報道，并且缺乏我國少數民族人種的相關研究。因此，我們通過Sanger測序法對122例云南彝族前列腺癌患者與135例云南彝族非前列腺癌健康男性的 SRD5A2基因 rs523349（V89L）、rs9282858（A49T）和TA重復序列多態性進行檢測，從而分析云南省彝族人群中SRD5A2基因多態性與前列腺癌的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年5月至2017年5月在昆明醫科大學第一附屬醫院就診的122例云南彝族前列腺癌患者為病例組，所有前列腺癌患者均經前列腺穿刺病理證實，年齡51～83歲，平均（65.3±3.8）歲；同期選擇135例在我院體檢中心體檢的年齡匹配的云南彝族非前列腺癌健康男性作為對照組，年齡52～85歲，平均（66.7±3.2）歲。兩組年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。經我院倫理委員會批準后開始研究，所有入選對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本收集及基因組DNA提取 分別收集符合條件受檢者外周靜脈血3 mL，EDTA抗凝，-80℃冰箱保存。根據DNA鹽析提取量化標準協議，用酚/氯仿的混合液進行抽提，稀釋至 10 μg/μL，置于-20℃冰箱備用。

1.2.2 相關引物 根據核苷酸序列應用Primer 5.0軟件設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 SRD5A2基因多態性位點引物序列Tab.1 Primer sequence of SRD5A2 gene polymorphic loci

1.2.3 PCR反應 30 μL PCR反應體系的配制：10× Taq DNA 聚合酶（rTaq）緩沖液 3 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，rTaq 0.2 μL，50%二甲基亞砜（DMSO）1 μL，正、反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，去離子水19.8 μL。PCR反應條件：預變性溫度95℃ 3 min，變性溫度94℃ 30 s，退火溫度60℃45 s，延伸溫度72℃45 s，修復延伸溫度72℃5 min，循環數35次。

1.2.4 基因多態性檢測 （1）準備模板：質粒、PCR產物。（2）電泳檢查DNA濃度和質量；檢測質粒抽取的質量。（3）測序PCR反應：測序試劑體系配制按ABI Big Dye v3.1測序說明書進行。測序PCR循環條件：96℃ 1 min；25個循環：96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 4 min；4℃保溫。（4）純化測序產物（上機前純化）。（5）ABI 3730XL測序儀上機電泳。（6）分析數據。

1.3 統計學方法 應用IBM SPSS 19.0統計軟件，SRD5A2基因多態性位點的基因型和等位基因用計數和百分數表示，Hardy-Weinberg平衡檢驗以及對病例、對照兩組間多態性位點的基因型和等位基因分布的比較均采用卡方檢驗，并通過計算優勢比（OR）及95%置信區間（95%CI）來判斷其與前列腺癌的關聯強度。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 分別對病例組及對照組中所檢測到的SRD5A2基因多態性位點（rs523349、rs9282858和TA重復序列）的基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗（表2）。結果提示這3個多態性位點其基因型在病例組及對照組中分布均符合Hardy-weinberg平衡（P＞0.05），說明本研究對象具有群體代表性。

2.2 SRD5A2基因多態位點的基因型和等位基因頻率在病例組和對照組中的分布 在病例組和對照組中均未發現SRD5A2基因rs9282858位點的AA基因型。兩組間SRD5A2基因位點rs523349和rs9282858的基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義（P＞0.05）。而兩組間TA重復序列位點的基因型和等位基因頻率分布差異有統計學意義（P＜0.05），在病例組中含有9次TA重復的基因型［（TA）0（TA）9+（TA）9（TA）9］較對照組多見（P=0.033）。與攜帶0次TA重復［（TA）0］等位基因者相比，攜帶9次TA重復［（TA）9］等位基因者患前列腺癌的風險明顯增高（OR=2.181，95%CI：1.111 ～ 4.281，P=0.021），見表3。

3 討論

前列腺癌是一種雄激素依賴性疾病，雄激素在前列腺癌的發生、進展中具有非常重要的作用，所以參與雄激素合成和代謝的基因都可能是前列腺癌的危險因素［4］。睪酮5-α還原酶能夠在雄激素合成過程中將睪酮轉換為更具有活力的雙氫睪酮（DHT）［5］。其有睪酮5-α還原酶Ⅰ（SRD5A1）和

睪酮5-α還原酶Ⅱ（SRD5A2）兩種亞型，分別由SRD5A1和 SRD5A2基因編碼［5］。在兩者中，SRD5A2在雄激素敏感組織（例如：前列腺、睪丸）中具有高表達，并且能夠明顯增強DHT的生物活性以及與雄激素受體的親和力，所以SRD5A2可能對前列腺癌的發生產生影響，SRD5A2基因被認為是前列腺癌發病重要的候選基因［6］。近10多年來，SRD5A2基因多態性和前列腺癌易感性之間的關系受到人們的廣泛關注。但是，這些研究大多集中于歐美人群，僅有少量中國漢族人群的研究報道，而缺乏我國少數民族人種的相關研究。彝族作為云南人口最多的少數民族之一，亦具有一定的前列腺癌發病率，在彝族人群中研究前列腺癌的易感性對于我們理解和治療該疾病都具有很重要的意義。

表2 SRD5A2基因多態性位點Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗Tab.2 Hardy-Weinberg Genetic balance test of SRD5A2 gene polymorphic loci

表3 SRD5A2基因多態位點的基因型和等位基因頻率在病例組和對照組中的分布Tab.3 Distribution of genotype and allele frequencies in the case group and the control group of the SRD5A2 gene polymorphic loci 例（%）

SRD5A2基因位于2號常染色體短臂（2p23），全長超過40 kb，由5個外顯子和4個內含子構成［7］。目前已發現SRD5A2基因中存在多個多態性位點 ，但是rs523349（V89L）、rs9282858（A49T）和TA重復序列多態性是最常見的，也是被研究最多的［8］。rs523349（V89L）多態性是發生在SRD5A2基因第89密碼子的一個錯義替代，GUA堿基中G變為C，纈氨酸（Val）由亮氨酸（Leu）替代；rs9282858（A49T）多態性是發生在SRD5A2基因第49密碼子的另一個錯義替代，GCC堿基中變為A，丙氨酸（Ala）由蘇氨酸（Thr）替代，因此它們能夠通過氨基酸的替代來影響SRD5A2的活性［8］。而TA重復序列多態性位于SRD5A2基因的3′非編碼區，是一個長度多態性，它不能影響所形成蛋白質的結構和功能，但是它可以通過改變mRNA的穩定性來調節SRD5A2的產生［8］。

NWOSU等［9］研究顯示rs523349位點的錯義替代發生率在高加索人中為8.5%，在非裔美國人中為2.5%，在臺灣人中為28%。一些研究發現rs523349位點的基因型分布與高風險和低風險人群前列腺癌發病率的分布相一致，CC基因型的發生率在亞洲人群中為22%～25%，而在高加索人群和非裔美國人群中僅為4%；但是GG基因型的發生率在亞洲人群中為27%～29%，而在高加索人群和非裔美國人群中卻為58%［10-11］。并且MAKRIDAKIS等［12］通過體外實驗發現：同GG基因型相比，CC基因型能夠降低5-α還原酶42%的活性。但是關于法國和瑞士人群的研究卻發現CC基因型和前列腺癌的易感性相關［13-14］。LI等［6］通過對31個關于rs523349位點基因型的研究進行Meta分析發現：同G等位基因相比，C等位基因和前列腺癌的易感性無關。與Meta分析結果相似，在本研究中rs523349位點的基因型和等位基因頻率分布在前列腺癌組和對照組之間沒有統計學差異。本研究結果與文獻報道的遼寧省漢族人群的研究結果一致［15］。

目前研究發現rs9282858位點丙氨酸（Ala）和蘇氨酸（Thr）的錯義替代和前列腺癌的病理特點有關，它能夠增加5-α還原酶5倍的活性［16］。AA基因型在高加索人群中最常見（3.5%），其次為非裔美國人，亞洲人群或者拉美人群［16］。MAKRIDAKIS等［10］報道rs9282858位點的錯義替代和非裔美國人群及拉美人群的高前列腺癌發病率顯著相關，并且在進展性和預后不良的前列腺癌患者中過度表達。但是也有一些研究發現在高加索人群和亞洲人群中rs9282858多態性和前列腺癌的易感性無關［17-19］。本研究未發現rs9282858位點的AA基因型，并且GA基因型在前列腺癌組（8.2%）和對照組（6.7%）中的頻率也很低，rs9282858多態性與前列腺癌發病風險性無關。本研究結果與文獻報道的國內北方漢族人群研究結果相似［20］。

本研究所涉及的3個多態性位點中，TA重復序列多態性是相對研究較少的，至今為止，已發現至少10個TA重復序列多態性的等位基因［（TA）0，（TA）8，（TA）9，（TA）10，（TA）17，（TA）18，（TA）19，（TA）20，（TA）21，（TA）22］，但是僅有（TA）0，（TA）9和（TA）18這3個等位基因比較常見，而（TA）0是所有人群中最常見的，（TA）18僅出現在非裔美國人群中［7］。由于具有（TA）18等位基因的非裔美國人群比亞裔美國人群和高加索人群具有更高的前列腺癌發病率，并且在30個前列腺癌患者中有56%的患者存在這個位點的體細胞突變，因此這個位點的多態性可能和前列腺癌的易感性相關。目前TA重復序列長度對5-α還原酶的影響還沒有在體外實驗中被證實。近年來一些研究發現（TA）9等位基因和前列腺癌的易感性相關［8］，但是也有一些研究發現TA重復序列長度和前列腺癌的發病沒有相關性［21-22］。NTAIS等［23］通過Meta分析發現TA重復序列多態性可能對前列腺癌易感性有一定影響。在本組研究中，（TA）0等位基因是最常見的（病例組為89.3%，對照組為94.8%），沒有發現（TA）18等位基因，攜帶（TA）9等位基因者較攜帶（TA）0等位基因者患前列腺癌的風險明顯增高（OR=2.181，95%CI：1.111 ～ 4.281，P=0.021）。

本研究與其他一些學者研究的結果存在一定差異，可能與遺傳風險因素在不同種族中的作用不同有關，也可能與不同人群基因多態性分布不均有關。本研究局限性主要是樣本含量較小，僅研究了云南彝族前列腺癌與SRD5A2基因多態性的關系，而缺乏多民族之間的比較，并且研究位點沒有包括其他和雄激素合成代謝相關的基因位點。為解決上述問題，我們可以加大樣本含量，將研究對象范圍擴大到云南漢族、白族和傣族，進行民族間的比較，并且將研究位點擴大到雄激素受體（AR）基因多態性位點和維生素D受體（VDR）基因多態性位點。

綜上所述，本研究是首次對云南少數民族彝族人群進行SRD5A2基因多態性與前列腺癌相關性研究，結果表明SRD5A2基因TA重復序列多態性與前列腺癌發病危險相關。這為云南彝族前列腺癌的基因危險因素研究提供了基礎，并且為后期我們增加樣本含量來加強我們結論的可靠性提供了方向。

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