顆粒細胞端粒長度預測胚胎發育潛能及妊娠率的臨床研究

李楠 唐妮 韋立紅 李忻琳 林忠

柳州市婦幼保健院生殖醫學中心（廣西柳州545001）

人類輔助生育技術（assisted reproductive technology，ART）已經歷了30多年的發展，獲得了一系列的突破性進展，成為不孕不育夫婦治療的首選［1］。移植高質量的胚胎將可以決定臨床妊娠率，因此胚胎質量是決定胚胎移植成功的關鍵因素。目前臨床上主要應用形態學方法篩選胚胎，形態學評估由于其無創，操作簡便等優點，成為目前實驗室胚胎選擇的常規方法［2］。該方法是指在倒置顯微鏡下，對不同發育時期的胚胎進行形態學評分，將評分結果好的胚胎用于移植［3］。但是該方法存在缺陷，如胚胎形態學評分并不能全面地反映胚胎的發育潛能，過多依賴于實驗室技術人員的主觀判斷標準，觀察時間過短，數據之間缺乏聯系，同時缺少客觀可量化的指標等［4］，都有可能影響最終臨床妊娠率（pregnancy rate，PR）。因此如何提高預測早期胚胎發育潛能的能力和臨床妊娠率成為ART面臨的巨大問題，發現新的胚胎發育潛能標記物成為胚胎學家的研究熱點［5］。

卵母細胞顆粒細胞作為卵母細胞生存的主要內環境，對卵母細胞的營養和成熟起到非常重要的作用［6］。卵丘顆粒細胞和卵母細胞形成卵丘-卵母細胞復合體，與卵母細胞間存在著廣泛的細胞間連接，參與卵泡的募集、發育和優勢化，保證卵母細胞正常的成熟分裂過程。相互交換物質、促進卵母細胞發育、成熟［7］。端粒（telomere）是線狀染色體末端的DNA重復序列（TTAGGG），隨著細胞分裂而逐漸縮短到一定程度后細胞會發生凋亡。端粒的功能包括維持染色體結構的完整性，防止染色體被核酸酶降解及染色體間相互融合，防止染色體結構基因在復制時丟失，細胞的凋亡也受到端粒和端粒酶調控［8］。隨著細胞分裂，端粒不斷縮短，當端粒縮短至其閾值時細胞凋亡。研究卵母細胞周圍的顆粒細胞端粒，將為成熟卵母細胞、優質胚胎選擇提供客觀、準確且無創的方法，從而提高妊娠率［9］。LIU等［10］建立了敲除小鼠端粒酶基因的模型，研究其代數與繁殖力的關系，結果發現隨著代數增加，獲卵數、受精率、優胚率和種植率逐漸降低。YAMADA等［11］研究認為高齡小鼠卵母細胞質量下降的原因與胞質內活性氧基團的積累有關。隨著年齡增加，端粒逐漸縮短，活性氧基團累積越多，會破壞染色體的穩定而影響繁殖能力。國內有文章顯示卵丘顆粒細胞端粒長度與卵母細胞的成熟度和妊娠結局密切相關，具有較高的臨床研究價值［12］。但是仍然需要大樣本多中心的研究數據。

本研究選擇2015年1月至2017年6月在柳州市婦幼保健院生殖健康助孕中心行ICSI-ET的患者，通過測定患者顆粒細胞端粒的相對長度，研究不同年齡組的端粒長度與臨床妊娠結局的關系，為臨床胚胎移植時選擇最具發育潛能的胚胎提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年10月至2017年6月在柳州市婦幼保健院生殖健康助孕中心行ICSI-ET的患者納入本研究。所選患者之間女方年齡、不孕年限、內膜準備方案等方面比較，差異均無顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 入選患者基本信息Tab.1 Demographic data for couples undergoing ARTs

1.2 控制性超促排卵 所有患者均采用柳州市婦幼保健院生殖健康助孕中心常規的促排卵方案。在月經周期的第4天開始促排，根據B超監測和血清雌二醇（Estradiol，E2）水平調整藥物劑量，當優勢卵泡直徑達18 mm時肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）（Serono，德國）10 000 U，34～36 h后在B超引導下取卵［13］。

1.3 ICSI與胚胎培養 精液收集及處理方法按照我中心常規處理方法簡述如下，男方通過手淫法取精，液化后使用Isolate密度梯度離心法（Irvine，America）對精液進行梯度離心，G-IVF授精液（Vitro Life，Sweden）上游法處理精液。

卵子放入G-IVF中2～5 h后，經過酶消化后去除顆粒細胞，行ICSI授精，轉入序貫培養液Cook，觀察受精情況并進行原核評分。第3天觀察胚胎分裂情況即常規評估胚胎。根據患者簽署知情同意書的情況將剩余胚胎進行繼續囊胚培養或冷凍。培養至第5天或第6天觀察囊胚形成情況進行將囊胚移植或者冷凍。

胚胎培養及受精所用液體均在CO2培養箱（6.0%CO2、37℃、100%濕度環境）中平衡過夜［14］。

1.4 胚胎移植及妊娠判斷 將胚胎轉移至移植導管在B超引導下移植入患者子宮。胚胎移植后D15檢測血hCG，D35超聲檢查見妊娠囊和心血管波動判定為臨床妊娠。

1.5 顆粒細胞的采集與保存 經陰道超聲引導下穿刺取卵，將卵母細胞及顆粒細胞放入G-IVF中2～5 h后，經過酶消化后去除顆粒細胞，將顆粒細胞混合，在PBS緩沖液中1 500 r/s×5 min，反復離心洗滌3次后將所收集的顆粒細胞轉移至EP管中，將收集顆粒細胞的EP管置于-80℃冰箱中冷凍保存備用。

1.6 提取顆粒細胞的DNA和檢測端粒長度

1.6.1 DNA提取 DNA提取試劑盒（DNeasy Tissue Kit，Qiagen，Inc.Mississauga，Ontario，Canada）用于提取顆粒細胞中的DNA。簡述如下，將顆粒細胞沉淀中加入Protease K 20 μL、Buffer AL 200 μL，混勻后56℃水浴10 min。加入無水乙醇200 μL/管，混勻后轉移入Spin Colunm，室溫下以13 200 r/min離心2.5 min。棄濾液，將Spin Column移入清潔收集管中，加 AWl液 600 μL，室溫下以 13 200 r/min離心2.5 min。棄濾液，將Spin Column移入另一清潔收集管中加AW2液600 μL，室溫下以13 200 r/min離心2.5 min。棄濾液，將Spin Column轉移入已標患者姓名的新1.5 mL離心管中，加Buffer AE 300 μL，室溫下以13 200 r/min離心2.5 min。核對標本姓名及編碼，收集離心管內液體（即提出的DNA），用超微量分光光度計測定OD260和OD280，-20℃保存備用。取DNA溶液1 μL分別測260、280 nm波長下的光密度（OD）值，然后計算OD260nm/OD280nm的比值。

1.6.2 引物的設計、合成與端粒長度檢測 引物設計參照文獻，由廣州艾基生物技術有限公司合成，PCR反應引物序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primers sequences

1.6.3 QRT-PCR反應體系及條件 QRT-PCR購買北京康為世紀公司試劑盒，PCR儀為ABI7500。按照表3的反應體系進行試驗。具體反應條件及步驟如下，（1）第一步：（預變性）94℃ 5 min，1個循環；（2）第二步：（PCR反應）94℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃30 s、83 ℃ 20 s（測定熒光），40個循環；（3）第三步：（溶解曲線分析）95℃ 20 s、65℃ 15 s、95℃ 0 s，1個循環。每次qRT-PCR反應均重復3次，根據CAWTHON等［15］的公式計算端粒長度：T/S相對比值=2-（△Cts-Ctc）=2-△△Ct。注：△Cts=Ct（telomeres）sample-Ct（36B4）sample，△Cts=Ct（telomeres）calibrator-Ct（36B4）calibrator。

表3 反應體系Tab.3 Reaction system

1.7 統計學方法 采用Excel 2007進行數據錄入，使用SPSS 19.0進行統計分析，定量資料兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，將卵母細胞顆粒細胞端粒長度與臨床妊娠率之間進行單因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同年齡組別顆粒細胞端粒長度差異的研究 低齡組顆粒細胞端粒長度與高齡組比較差異有統計學意義（4.69±0.88vs.3.78±0.69，P＜0.05）。隨著年齡增加，顆粒細胞端粒長度呈現逐漸降低的趨勢。

2.2 低齡組和高齡組患者妊娠者與未妊娠者端粒長度比較 見表4，低齡組高發育潛能胚胎的卵母細胞顆粒細胞的端粒長度大于低發育潛能胚胎（P＜0.05）。見表5，高齡組高發育潛能胚胎的卵母細胞顆粒細胞的端粒長度大于低發育潛能胚胎（P＜0.05）。

表4 低齡組（≤35歲組）卵母細胞顆粒細胞端粒長度及胚胎發育情況比較Tab.4 Effects of telomere length in granulosa cells of patients with different age on ICSI treatment ±s

表4 低齡組（≤35歲組）卵母細胞顆粒細胞端粒長度及胚胎發育情況比較Tab.4 Effects of telomere length in granulosa cells of patients with different age on ICSI treatment ±s

胚胎發育情況妊娠組（高發育潛能的胚胎）未妊娠組（低發育潛能的胚胎）顆粒細胞端粒長度（T/S值）4.69±0.78 3.25±0.56

表5 高齡組（＞35歲組）卵母細胞顆粒細胞端粒長度及胚胎發育情況比較Tab.5 Effects of telomere length in granulosa cells of patients with different age on ICSI treatment ±s

表5 高齡組（＞35歲組）卵母細胞顆粒細胞端粒長度及胚胎發育情況比較Tab.5 Effects of telomere length in granulosa cells of patients with different age on ICSI treatment ±s

胚胎發育情況妊娠組（高發育潛能的胚胎）未妊娠組（低發育潛能的胚胎）顆粒細胞端粒長度（T/S值）4.09±0.93 2.92±0.84

2.3 端粒長度與臨床妊娠率的相關性分析 見表6，Logistic回歸顯示端粒長度與臨床妊娠率（≤35歲組和＞35歲組）有關。

表6 Logistic邏輯回歸分析端粒長度與臨床妊娠率的關系Tab.6 Logistic analysis of pregnancy rate according to different age

3 討論

端粒是染色體末端一種特殊的帽狀結構，由重復串聯的TTAGGG序列和酶構成［9］，在維持染色體結構的完整性，防止染色體被核酸酶降解及染色體間相互融合，防止基因在復制時丟失等方面起到重要作用。端粒是細胞的“生命時鐘”，細胞每分裂一次，端粒DNA就會減少一定的數目，當端粒長度縮短到極限時細胞就會停止分裂，失去保護染色體末端的能力，進而出現染色體變性、溶解，引起細胞衰老或死亡。端粒除了受年齡影響外，還受如端粒酶活性、環境因素等因素的影響。

卵泡的發育及成熟是一個高度復雜而有序的過程。卵泡發育的過程是卵母細胞和顆粒細胞相互作用、共同成熟的過程。顆粒細胞作為卵母細胞生存的內環境，參與卵泡的募集、發育，在卵母細胞成熟過程中互相作用，提供營養，保證卵母細胞正常的成熟。GUO等［16］研究證明端粒越長其所對應的卵母細胞發育潛力越強，而端粒長度較短的卵母細胞發育的胚胎質量較差，同時顆粒細胞凋亡較多則不利于卵母細胞的成熟。FESAHAT等［17］研究顯示，通過利用模式生物大鼠研究發現，顆粒細胞端粒酶長度縮短可能導致卵泡發生閉鎖。顆粒細胞中特定的基因與卵母細胞減數分裂和胞核成熟密切相關。若顆粒細胞的端粒因缺乏端粒酶而不斷縮短，最終會阻礙卵母細胞成熟。在細胞分裂過程中會產生大量的氧自由基（ROX），ROX對鳥嘌呤特別敏感，ROX會結合到染色體末端的端粒上，大量的氧化反應會引起顆粒細胞染色體結構受損，引起顆粒細胞染色體斷裂，細胞衰老、凋亡。顆粒細胞的凋亡信號經過縫隙連接進入卵母細胞而影響卵母細胞的成熟。

端粒與女性生殖能力密切相關。隨著女性年齡得增加，卵巢功能呈現下降的趨勢。細胞復制次數隨著年齡而增多，所獲得卵母細胞的質量也呈現下降的趨勢，染色體異常率增加，女性的生殖能力顯著下降。本研究發現，顆粒細胞端粒長度與年齡呈負相關，與其他研究結果相似。其原因為顆粒細胞凋亡率增加，導致卵母細胞質量下降，胚胎發育能力下降，胚胎移植后妊娠率降低［18］。也有學者研究了大鼠卵泡閉鎖與端粒酶之間關系，結果發現端粒酶活性降低導致端粒縮短，進而引起卵泡閉鎖，卵母細胞成熟率下降［19］，提示顆粒細胞的凋亡與卵母細胞的成熟、受精能力及早期胚胎質量密切相關。在2000年HOST等［20］的研究也得到相似的結果。CHENG等［21］對顆粒細胞與胚胎發育能力的研究結果發現，較長端粒的顆粒細胞有利于形成優質成熟的卵母細胞和高質量胚胎。

高質量的胚胎的顆粒細胞端粒長度要大于低質量胚胎的顆粒細胞端粒長度，且具有較高的妊娠率。因此顆粒細胞中端粒長度可以在某種程度上反映卵母細胞和胚胎中的受精及發育潛能。BUTTS等［22］研究發現，卵巢儲備不好的女性其端粒長度要明顯小于較儲備正常的女性。在卵巢功能減弱的患者也得到相似規律。因此，端粒與生殖能力存在密切的相關性。KEEFE等［23］通過追蹤IVF妊娠結局的研究發現，妊娠組較高齡者的端粒長度要大于未妊娠組。國內學者也有進行相關的研究，對不同年齡段患者妊娠和未妊娠者顆粒細胞端粒進行比較發現，高齡組妊娠者顆粒細胞端粒較長，但是在低齡組妊娠和未妊娠患者中無此差異［24］，與本研究結果相似。本研究首次在臨床應用中使用顆粒細胞端粒長度與形態學評分法相結合，在一定程度上提高了預測早期胚胎發育的能力，改善了臨床妊娠率。

綜上所述，端粒在女性的生殖與卵巢功能中起重要作用，與生殖能力存在密切的相關性。顆粒細胞的凋亡程度直接影響卵泡發育和胚胎質量，調控顆粒細胞端粒縮短的信息通過某種作用機制影響卵母細胞，從而對胚胎質量及最終臨床妊娠結局產生影響。如何加深對顆粒細胞與胚胎質量之間分子機制的研究，延緩端粒縮短，改善卵母細胞和胚胎質量，還有待進一步研究。

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