宮頸上皮內瘤變及宮頸癌組織中變異型分化抗原簇44(17)的表達及意義

殷新明，許文林，朱小蘭，劉月琴

(江蘇大學第四附屬醫院/鎮江市婦幼保健院婦科，江蘇鎮江 212001)

宮頸癌是世界范圍內的第三大女性常見癌癥，伴有較高的病死率[1]。宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是宮頸癌的癌前病變，從CIN發展到宮頸癌需經歷一段較長的時間[2]，在這個過程中如果進行規范的宮頸癌篩查，及時早期作出診斷并實施規范的治療，發生宮頸浸潤癌的概率會大大降低[3]。因此，重視CIN的早期診治，可以在CIN階段阻斷宮頸癌的發生。本文通過探討各期CIN(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級)及宮頸癌組織中變異型分化抗原簇44(17)(CD44v17)的表達變化及意義，并進一步研究CD44v17與基質金屬蛋白酶9(MMP9)、細胞核增殖相關抗原Ki67的關系，為CIN及宮頸癌的早期診斷、早期治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人宮頸癌Hela和Siha細胞株購自南京凱基生物科技有限公司。

1.1.2實驗動物 4～5周齡雌性BALB/c(nu/nu)裸鼠28只，體質量14～17 g，購自揚州大學醫學實驗中心，在本院中心實驗室飼養。飼養條件為20～22 ℃的屏蔽系統，室內相對濕度為40%～60%，無特定病原體。裸鼠以高壓滅菌的水和標準飼料飼喂。

1.1.3臨床資料 選取2014年1月至2016年12月于本院婦科陰道鏡室檢查的患者400例，將其分為5組：正常宮頸、CINⅠ級、CINⅡ級、CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌，每組80例。所有CINⅡ級、CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌均經后續的宮頸錐形切除或子宮切除證實相符。

1.1.4實驗試劑 TRIzol試劑、RNA酶抑制劑均購自美國Invitrogen 公司。反轉錄、熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司(RR716)。引物均由廣州復能基因有限公司合成。CD44v17 siRNA序列及CD44v17 shRNA慢病毒顆粒由上海吉凱生物技術有限公司合成構建。

1.2方法

1.2.1標本采集 患者陰道鏡下活檢時同時取材，取材后立即于-80 ℃下凍存。正常宮頸組織取自子宮良性疾病行全子宮切除標本，且術前人乳頭瘤病毒(HPV)檢查陰性、液基薄層細胞檢測(TCT)未見異常、術后病理宮頸無異常。

1.2.2實驗方法 人宮頸癌細胞株培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基(100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)，選取對數生長期的細胞作為實驗對象。目的基因的檢測包括：(1)細胞總RNA的提取。(2)反轉錄反應。(3)實時熒光定量PCR法檢測目的基因相對表達水平。采用2-ΔΔCt法對目的基因相對表達水平進行分析，以內參基因三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為標準，ΔΔCt=ΔCt(實驗組)-ΔCt(對照組)，ΔCt=Ct目的mRNA-CtGAPDH mRNA。計算實驗組相對于校準內參組目標基因增加或減少的倍數。(4)選用前期體外實驗驗證有效的CD44v17 siRNA序列，宮頸癌HeLa和宮頸癌SiHa細胞干擾CD44v17 siRNA后，實時熒光定量PCR法檢測Ki67和MMP9的表達。(5)取BALB/c裸鼠28只，背部皮下接種1×106個細胞/只。每隔3 d用測量裸鼠皮下腫瘤的長短徑計算體積并繪制出腫瘤生長曲線[腫瘤體積(TV)=長徑(mm)×短徑2(mm2)×0.5]。待所有皮下瘤生長至最大直徑大于或等于5 mm時，隨機分為兩組：CD44v17 shRNA慢病毒顆粒組、siRNA陰性對照組，每組14只，繼續飼養。各組瘤體內分別注射陰性對照病毒顆粒(0.5×108TU/mL)、含CD44v17基因慢病毒顆粒(0.5×108TU/mL)相應藥物100 μL，每3天1次，共6次。慢病毒顆粒注射后第20天，取腫瘤組織。

2 結 果

2.1組織中CD44v17的表達 正常宮頸組織、CIN組織、宮頸鱗狀細胞癌組織的CD44v17表達陽性率逐漸升高，呈遞增趨勢。以正常宮頸組織作為對照，CINⅠ級組織CD44v17表達水平上升，但差異無統計學意義(P=0.056 0)；CINⅡ、CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌組織CD44v17表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.01)。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌組織CD44v17表達水平兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.01，與正常宮頸組織比較；#：P<0.01，與CINⅠ級組織比較；△：P<0.01，與CINⅡ級組織比較；▽：P<0.01，與CINⅢ級組織比較

圖1 CD44v17在各級CIN和宮頸癌中的表達

2.2組織中MMP9的表達 在CIN向宮頸癌演變進展過程中，組織中MMP9的表達呈逐漸升高的趨勢，在CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌組織間MMP9的增幅更加明顯。以正常宮頸組織作為對照，CINⅠ級組織MMP9表達水平上升，但差異無統計學意義(P=0.061 2)；CINⅡ、CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌組織MMP9表達水平上升，差異有統計學意義(P<0.01)。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌組織間MMP9表達水平兩兩比較，差異均有統計學意義(其中CINⅡ級和CINⅢ級組織間P<0.05，其余P<0.01),見圖2。

*：P<0.01，與正常宮頸組織比較；#：P<0.01，與CINⅠ級組織比較；△：P<0.05，▲:P<0.01,與CINⅡ級組織比較；▽：P<0.01，與CINⅢ級組織比較

圖2宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組織中MMP9的表達

2.3組織中Ki67的表達 在CIN向宮頸癌演變進展過程中，組織中Ki67的表達呈逐漸升高的趨勢，且病變級別越高，Ki67的增幅越明顯。以正常宮頸癌組織作為對照，CINⅠ級組織Ki67的表達水平上升，但差異無統計學意義(P=0.079 0)；CINⅡ、CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌組織Ki67的表達水平上升，差異有統計學意義(正常宮頸與CINⅡ級組織間P<0.05，其余P<0.01)。CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ級和宮頸鱗狀細胞癌組織Ki67的表達水平兩兩比較，CINⅠ級和CINⅡ級間差異無統計學意義(P=0.119 5)，其余差異有統計學意義(其中CINⅡ級和CINⅢ級間P<0.05，其余P<0.01)，見圖3。

*：P<0.05，#：P<0.01，與正常宮頸組織比較；△：P<0.01，與CINⅠ級組織比較；▽：P<0.05，▲：P<0.01，與CINⅡ級組織比較；▼：P<0.01，與CINⅢ級組織比較

圖3宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組織中Ki67的表達

2.4CD44v17對MMP9、Ki67表達的影響 人宮頸癌Hela和Siha細胞干擾CD44v17 siRNA后，MMP9、Ki67的表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。Hela和Siha細胞的表達相似，圖為Hela細胞表達,見圖4。

2.5CD44v17對荷瘤裸鼠成瘤的影響 CD44v17 shRNA慢病毒顆粒組的腫瘤體積明顯小于siRNA陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；腫瘤質量也明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01),見圖5～7。

A：MMP9的表達；B：Ki67的表達；*：P<0.000 1，與siRNA陰性對照比較

圖4干擾CD44v17 siRNA后宮頸癌細胞MMP9與Ki67的表達

圖5 兩組荷瘤裸鼠腫瘤體積比較

*：P<0.000 1，與shRNA陰性對照組比較

圖6兩組荷瘤裸鼠腫瘤質量比較

A：shRNA陰性對照組；B：CD44v17 siRNA慢病毒顆粒組

圖7兩組荷瘤裸鼠

3 討 論

CD44基因蛋白與透明質酸等基質中的分子結合，可以促進惡性腫瘤細胞的增殖和侵襲。BOURGNIGNON等[4]認為，CD44通過與透明質酸結合，可以激活酪氨酸激酶，從而下調腫瘤抑制蛋白，重塑細胞骨架，使癌細胞的侵襲性增強。研究表明，某些CD44分子表達異常可顯著提高惡性腫瘤細胞的轉移能力[5-6]，并且與腫瘤惡性程度密切相關[7]。CD44剪接變異體(CD44v)與多種惡性腫瘤的發生、發展有著密切關系，是腫瘤發生轉移的重要因素，可以作為一個較好的預測腫瘤轉移擴散能力和預后情況的指標[8]。

細胞外基質(ECM)是惡性腫瘤細胞發生浸潤和轉移的主要障礙，在腫瘤的侵襲與轉移過程中必須水解ECM[9]，這一過程需要多種蛋白水解酶，其中常見的水解酶有基質金屬蛋白酶類(MMPs)。這一家族中MMP9是Ⅳ型膠原降解的主要作用酶之一，在其作用下ECM中的Ⅳ型膠原降解，破壞ECM并促進腫瘤血管形成，推動了惡性腫瘤細胞浸潤和轉移的進程。腫瘤分期、惡性程度、轉移能力與MMP9的表達水平呈正相關[10-11]。Ki67是一種與DNA結合的核內蛋白，僅表達于細胞增殖期，能夠較好地判斷腫瘤的生長增殖特性，與腫瘤的侵襲性呈正相關，因此Ki-67可作為判斷腫瘤侵襲性的指標之一[12-13]。腫瘤組織Ki67陽性率升高，說明腫瘤組織中處于增殖周期的細胞比例越高，即Ki67陽性率越高，腫瘤生長越快、分化越差。

目前普遍認為宮頸癌是人類惟一一種可以阻斷的癌癥。CIN為絕大多數浸潤性宮頸癌浸潤發生之前的一個必經時期，在這個過程中如果進行規范的宮頸癌篩查，及時作出正確診斷并實施規范有效的治療，完全可以在該階段阻斷宮頸癌的發生，發生宮頸浸潤癌的概率會大大降低[3]，從這一角度顯示出早期診斷治療CIN的重要性。

在本實驗中CD44v17的表達在正常宮頸組織、逐級升高的CIN組織和宮頸癌組織中逐漸升高，說明CD44v17介入了宮頸癌腫瘤的進展過程。本研究結果顯示，CD44v17的表達發生改變從CINⅡ級后開始，在CINⅢ級與宮頸癌組織間的差異尤為明顯。CINⅠ級有可能向正常組織轉變，臨床傾向于觀察，CINⅡ、CINⅢ級患者需進一步治療。本研究CIN組織中CD44v17、MMP9、Ki67的表達逐漸升高，在CINⅠ級組織中表達升高不明顯，與臨床處置相吻合，病變繼續升級后CD44v17、MMP9、Ki67的增幅明顯增加。CD44v17能抑制宮頸癌細胞凋亡，促進宮頸癌細胞的生長，增強宮頸癌細胞的增殖遷移能力，從而促進宮頸癌腫瘤生長[14]。本研究在宮頸癌細胞株中干擾宮頸癌細胞CD44v17 siRNA后MMP9、Ki67的表達明顯降低，說明CD44v17、MMP9和Ki67在宮頸癌腫瘤細胞增殖和組織浸潤過程中共同起到了重要作用。荷瘤裸鼠體內成瘤情況顯示，干擾CD44v17 siRNA后荷瘤裸鼠成瘤的體積和質量均明顯降低，成瘤能力明顯降低，說明在體內CD44v17有促進宮頸癌腫瘤組織生長的作用。

綜上所述，CD44v17可促進宮頸癌腫瘤細胞增殖、組織浸潤，在CIN向宮頸癌發生、發展的過程中可能起到一定的促進作用，其機制將是今后研究工作的重點。CD44v17有望作為判定CIN是否具有惡變潛能及預后的重要指標之一，在臨床工作中，可以通過檢測CD44v17、MMP9和Ki67，評價CIN及宮頸癌患者的篩查、診斷，并有可能成為宮頸癌治療的新靶點。

[1]LI D，CHEN L，WANG H,et al．Clinical application of a rapid cervical cancer screening method:folate receptor-mediated staining of cervical neoplastic epithelia[J]．Asia Pac J Clin Oncol，2017，13(1)： 44-52.

[2]TSIKOURAS P，ZERVOUDIS S，MANAV B，et al．Cervical cancer:screening,diagnosis and staging[J]．J BUON，2016，21(2)：320-325．

[3]WRIGHT T C，MASSAD L S，DUNTON C J，et al．2006 consensus guidelines for the managemerit of women with cervical intraepithelial neoplasia or adenocarcinoma in situ[J]．J Low Genit Tract Dis，2007，11(4)：223-239.

[4]BOURGNIGNON L Y，WONG G，EARLE C，et al．Hyaluronan-CD44 interaction promotes microRNA signaling and Rho GTPase activation leading to tumor progression[J]．Small GTPasea，2012，3(1)：53-59．

[5]SHERIDAN C，KISHIMOTO V，FUCHS R K，et al．CD44+/CD24-breast cancer cells exhibit enhanced invasive pmperties,an early step necessary for metastasis[J]．Breast Cancer Res，2006，8(5)：R59.

[6]SLVEN M，KNLPINSKI J，GAFFNEY J，et al．Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease:Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways[J]．Matrix Biol，2006，26(1)：58-68.

[7]劉暉，周赟峰，曾四元，等．黏附分子CD44v6,ICAM-1與早期宮頸鱗癌淋巴結轉移的關系[J]．重慶醫學，2017，46(22)：605-608．

[8]馮凡，曹衛平，陳琦，等．CD44剪接變異體(CD44v)在腫瘤中的研究進展[J]．生物學雜志，2017，34(1)：75-79．

[9]MARTINOU J C，YOULE R J．Mitochondria in apoptosis:Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J]．Dev Cell，2011，21(1)：92-101.

[10]薛清華．Rsf-1、MMP-9、TTF-1在肺癌及肺部良性病變中的檢驗結果分析[J]．檢驗醫學與臨床，2017，14(6)：885-887．

[11]彭海員，馬杰，朱慧芳，等．MMP -9與肺癌臨床病理特征及預后的關系[J]．臨床和實驗醫學雜志，2016，15(4)：322-325．

[12]YILMAZ M，VURAL E，KOC K，et al．Cavenous sinus invasion and effect of immunohistochemical features on remission ingrowth hormone secreting pituitary adenomas[J]．Turk Neurosurgery，2015，25(3)：380-388.

[13]何璐，郭亮，胡春洪，等．垂體腺瘤MRI Knosp分級與Ki-67、p53、MMP-9的相關性分析[J]．中華神經外科疾病研究雜志，2016，15(5)：410-413．

[14]殷新明，劉月琴，溫堅，等．變異型分化抗原簇44(17)對宮頸癌Hela細胞,Sila細胞系增殖的影響[J]．中國婦幼保健，2015，30(20)：3486-3490．