胃癌微環境中M2亞型巨噬細胞對胃癌間充質干細胞促腫瘤作用的影響

孫召東，張 婷，霍 娟，李 偉△

(江蘇省連云港市第一人民醫院：1.檢驗科；2.中心實驗室 222001)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國每年新增胃癌患者數量高達40多萬，其發病率及病死率在腫瘤相關疾病中排第3位[1]。針對胃癌發生、發展機制的研究也因此備受我國學者的關注。目前，腫瘤微環境對胃癌的影響已成為研究熱點之一[2-3]。其中，間質干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)與巨噬細胞等微環境細胞之間的相互作用對胃癌發生、發展的影響引起了科學家們的廣泛興趣。筆者前期研究發現，胃癌組織來源的MSCs(gastric cancer-derived MSCs，GC-MSCs)對胃癌細胞的增殖、遷移及促血管生成能力具有明顯的促進作用，且該作用與非腫瘤組織來源的MSCs，如胃癌癌旁組織來源的MSCs(GCN-MSCs)、骨髓來源的MSCs(BM-MSCs)相比更強[4]。然而，GC-MSCs發揮促胃癌作用的機制尚不清楚。大量研究證實，MSCs具有誘導巨噬細胞極化的作用，而M2亞型巨噬細胞已被證實可明顯促進腫瘤的生長、侵襲及轉移[5-6]。為此，本研究旨在探討胃癌發生、發展過程中，腫瘤組織內M2亞型巨噬細胞對GC-MSCs促胃癌效應的影響，并通過體外研究驗證GC-MSCs誘導胃癌微環境巨噬細胞向M2亞型極化的調節作用，為研究胃癌的發病機制提供更多的理論依據，并為胃癌的臨床治療提供新的靶點和思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本來源 留取本院胃癌切除手術患者新鮮胃癌及癌旁組織(距癌變部位5 cm以上，病理檢查無癌組織)，取材均取得患者家屬同意并簽署知情同意書。所有患者術前均未接受任何放化療，術后經病理確診為胃腺癌。

1.1.2主要儀器與試劑 L-DMEM營養液、RPMI1640營養液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；氯磷酸鹽脂質體(clodronate liposome，lipo-MBP)和對照(PBS liposome，lipo-PBS)(荷蘭Nicovan Rooijen公司)；佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA,美國Sigma-Aldrich公司)；Transwell板(美國Corning公司)；兔抗小鼠F4/80抗體和羊抗小鼠Ki67抗體(英國Abcam公司)；RNA反轉錄試劑盒(美國Roche Diagnostics公司)；PCR試劑盒(日本Takara公司)；二氧化碳培養箱(日本Sanyo公司)；NanoDrop-2000分光光度計(美國Thermo Scientific公司)；PCR儀(Veriti 96)(美國Applied Biosystems公司)；全自動凝膠成像儀(北京吉諾思科貿公司)。

1.2方法

1.2.1巨噬細胞體內清除 lipo-MBP或lipo-PBS分別按照100 μL/10 g小鼠體質量的劑量經尾靜脈注射，以清除體內單核/巨噬細胞，每4天注射1次，直至實驗觀察期結束(14 d)。

1.2.2裸鼠皮下致瘤實驗 選取3～4周齡雌性BALB/c裸鼠共20只，均購自南京大學-南京生物醫藥研究院[生產許可證號SCXK(蘇)2015-0001]。所有實驗動物均于本院神經醫學研究所動物中心飼養，并分為4組：lipo-PBS+BGC-823組、lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組、lipo-MBP+BGC-823組及lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組。皮下接種細胞14 d后，脫頸處死小鼠，剝離腫瘤組織，記錄其質量與體積后進行組織學分析。

1.2.3免疫組織化學法 將裸鼠皮下致瘤瘤體浸泡于中性甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋切片，經抗原修復處理后，依次加入Ki67抗體及生物素標記的二抗后孵育并顯色。倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。結果判定標準：棕黃色顆粒顯像為Ki67表達陽性反應。

1.2.4反轉錄PCR(RT-PCR) 法 收集lipo-PBS+BGC-823組和lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組裸鼠致瘤組織5對及胃癌患者癌與癌旁組織3對，TRIzol裂解后抽提組織來源總RNA。此外，采用20 ng/mL PMA刺激人單核細胞株THP-1分化為巨噬細胞后，將其與GC-MSCs進行體外共培養。72 h后，收集各處理組細胞并以TRIzol裂解抽提總RNA。小鼠iNOS、Ym-1和β-actin引物，人iNOS、Ym-1、Fizz-1和β-actin引物采用Primer Software軟件進行設計(表1)。利用NanoDrop-2000分光光度計對總RNA的純度和含量進行檢測。根據試劑盒提供的方案，以Superscript Ⅱ反轉錄酶在40 μL反應體系內對3 μg總RNA進行cDNA合成。25 μL PCR反應混合體系中分別含有Premix Ex Taq 12.5 μL、上下游引物各1.0 μL 及2 μL cDNA模板。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；退火溫度(Tm)30 s，72 ℃ 30 s,25～35個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5蛋白質印跡法(Western blot)檢測 收集小鼠及胃癌患者腫瘤組織，裂解液冰上提取蛋白。此外，將THP-1分化來源巨噬細胞與GC-MSCs進行72 h體外共培養，收集各處理組細胞并以裂解液冰上提取蛋白。取等量蛋白，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行蛋白分離，濕轉法轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%(質量/體積)脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗[抗Arginase-1、趨化因子受體-2(CCR-2)和β-actin]后，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫搖床孵育2 h，TBST洗膜3次，加入電化學發光(ECL)試劑顯色。全自動化學發光凝膠成像系統檢測并分析Western blot結果。

2 結 果

2.1巨噬細胞對GC-MSCs促胃癌效應的影響 裸鼠皮下致瘤實驗結果表明， lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤體積及質量均明顯高于lipo-PBS+BGC-823組，差異有統計學意義(P=0.009、0.001)，見圖1。采用lipo-MBP清除裸鼠體內單核/巨噬細胞后發現，lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組的腫瘤體積及質量與lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組相比明顯減小(P=0.028、0.009，圖1)，體內清除巨噬細胞顯著抑制了GC-MSCs的促胃癌效應。然而，lipo-PBS+BGC-823組和lipo-MBP+BGC-823組裸鼠皮下致瘤能力相比，差異無統計學意義 (P=0.251、0.175，圖1)。

2.2巨噬細胞對胃癌組織中腫瘤細胞增殖能力的影響 裸鼠腫瘤組織蘇木素-伊紅(HE)染色結果顯示，lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤病理組織學惡性程度最高，而給予巨噬細胞清除的lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組腫瘤惡性程度則明顯降低(圖2)。腫瘤組織Ki67免疫組織化學結果顯示，lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組棕黃色陽性細胞數量明顯高于lipo-PBS+BGC-823組，而體內清除巨噬細胞后lipo-MBP+BGC-823+GC-MSCs組裸鼠腫瘤組織中Ki67陽性增殖細胞數量較lipo-PBS+BGC-823+GC-MSCs組明顯減少(圖2)。此外，lipo-PBS+BGC-823組和lipo-MBP+BGC-823組胃癌組織中Ki67陽性細胞數量并無明顯差異，見圖2。

2.3裸鼠致瘤組織中M2亞型巨噬細胞相關基因轉錄及表達情況 RT-PCR檢測結果顯示，GC-MSCs共注射組腫瘤組織中iNOS mRNA轉錄水平明顯低于BGC-823單獨注射組；相反，M2亞型巨噬細胞相關基因Ym-1在GC-MSCs共注射組腫瘤組織中顯著高表達，見圖3A。Western blot檢測結果表明，M2亞型巨噬細胞主要的兩種相關蛋白精氨酸酶(Arginase-1)和CCR-2在GC-MSCs共注射組中的表達水平均明顯高于BGC-823單獨注射組，見圖3B。

表1 巨噬細胞M2亞型相關基因擴增上下游引物

A：BGC-823細胞皮下注射14 d后裸鼠致瘤情況；B：不同處理組腫瘤組織質量(n=5)；C：不同處理組腫瘤組織體積(n=5)；*：P<0.01；#：P<0.05

圖1巨噬細胞清除對GC-MSCs促胃癌能力的影響

圖2 不同處理組裸鼠致瘤組織HE染色及Ki67免疫組織化學染色(×200)

A：RT-PCR檢測結果；B：Western blot檢測結果

圖3 M2亞型巨噬細胞相關基因在裸鼠腫瘤組織中的轉錄及表達情況

2.4胃癌患者腫瘤組織中M2亞型巨噬細胞相關基因轉錄及表達情況 本研究選擇并觀察了3例臨床胃癌患者癌及對應癌旁組織中M2亞型巨噬細胞相關基因的轉錄、表達情況，由此判斷M2亞型巨噬細胞與GC-MSCs的組織學定位相關性。RT-PCR結果顯示，M1亞型巨噬細胞相關基因iNOS在3例患者癌旁組織中的轉錄水平明顯高于癌組織，而Ym-1在3例癌組織中的轉錄均明顯高于對應癌旁組織，見圖4A。Western blot檢測結果也表明，M2亞型巨噬細胞相關蛋白Arginase-1和CCR-2在癌組織中表達水平高于對應癌旁組織，見圖4B。

A：RT-PCR檢測結果；B：Western blot檢測結果

圖4 M2亞型巨噬細胞相關基因在胃癌患者癌及癌旁組織中的轉錄及表達情況

2.5GC-MSCs體外共培養對巨噬細胞向M2亞型轉換的影響 本研究分別采用間接與直接接觸共培養實驗評價了GC-MSCs對巨噬細胞亞型轉換的調節作用。培養72 h后RT-PCR結果顯示，GC-MSCs與巨噬細胞直接接觸共培養后其M2亞型巨噬細胞相關基因Ym-1、Fizz-1的mRNA轉錄水平明顯高于對照組，見圖5A。此外，巨噬細胞中Arginase-1和CCR-2蛋白的表達水平在GC-MSCs與巨噬細胞直接接觸共培養后也明顯升高，見圖5B。

A：RT-PCR檢測結果；B：Western blot檢測結果

圖5 GC-MSCs對巨噬細胞亞型轉換的調節作用

3 討 論

大量研究表明，基質細胞通過為腫瘤細胞提供有利微環境而在腫瘤的生長、轉移過程中發揮關鍵作用[7]。HASHIMOTO等[8]研究報道，巨噬細胞和BM-MSCs可被募集入神經母細胞瘤局部并分別活化為腫瘤相關巨噬細胞及癌相關成纖維細胞，從而為癌癥的發生、發展提供有利的微環境。同時，MSCs、巨噬細胞與腫瘤細胞三者之間的相互作用也已被證實在多種不同腫瘤的發展進程中發揮重要作用。YANG等[9]研究發現，巨噬細胞活化后的BM-MSCs可獲得促炎表型，且通過核因子-κB(NF-κB)信號通路的活化而促進胃癌細胞增殖與遷移。CHATURVEDI等[10]則指出，三陰性乳腺癌細胞與MSCs之間可通過缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)依賴的信號通路相互作用，從而促進巨噬細胞向原發性乳腺腫瘤局部的遷移富集。然而，腫瘤微環境局部MSCs、巨噬細胞與腫瘤細胞之間的相互調節，尤其基質細胞MSCs與腫瘤相關巨噬細胞之間的相互作用及其對腫瘤發生、發展的影響尚有待深入研究。

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，同時也是一類典型的炎癥相關性腫瘤。筆者前期研究發現，GC-MSCs通過分泌大量白細胞介素-8(IL-8)發揮較強的促胃癌作用[4]。盡管如此，GC-MSCs促腫瘤作用的機制，尤其是GC-MSCs與其他基質細胞之間的相互作用對胃癌發生、發展的影響尚無報道。ZHU等[11]研究指出，GC-MSCs與中性粒細胞之間的相互作用促進了胃癌細胞的侵襲及促血管生成能力，進而促成了癌細胞的轉移性播散。本研究發現，巨噬細胞在GC-MSCs的體內促胃癌效應中發揮必不可少的作用，清除巨噬細胞后裸鼠體內腫瘤生長明顯受到抑制。REN等[12]認為，淋巴瘤組織來源的MSCs(lymphoma-derived MSCs，L-MSCs)可明顯促進腫瘤生長，同時在體內實驗中進一步證實了單核/巨噬細胞(而非中性粒細胞)介導了L-MSCs的促腫瘤效應。這一結論與本研究是一致的。因此，深入研究腫瘤微環境中MSCs與巨噬細胞之間的相互作用將為闡明腫瘤發生、發展機制提供更多的信息。

目前，腫瘤基質中浸潤的巨噬細胞已被證實在腫瘤組織維持自身穩定及生長的過程中發揮關鍵作用[13]。它們主要分為經典活化的巨噬細胞(M1)及替代活化的巨噬細胞(M2)兩種不同亞型。其中，M2亞型巨噬細胞可促進腫瘤增殖并與多種不同腫瘤的預后不良密切相關。盡管如此，腫瘤組織中M2亞型巨噬細胞產生的機制尚不清楚。MATHEW等[14]研究了胰腺癌組織來源的MSCs，并證實該MSCs促腫瘤生長的作用與其誘導巨噬細胞向M2亞型極化密切相關。本研究中，聚集了GC-MSCs細胞的人、小鼠胃癌組織被檢測出較高比例的M2亞型巨噬細胞。此外，在GC-MSCs與巨噬細胞的體外共培養實驗中，進一步發現GC-MSCs直接接觸培養的巨噬細胞中M2亞型相關基因Ym-1、Fizz-1的mRNA轉錄及Arginase-1和CCR-2蛋白的表達水平均顯著增高，初步證實GC-MSCs促進巨噬細胞從M1向M2亞型轉換的調節作用。

綜上所述，胃癌微環境中M2亞型巨噬細胞參與了GC-MSCs的促腫瘤效應。同時，腫瘤基質中GC-MSCs對巨噬細胞由M1向M2亞型的極化過程具有調節作用?？梢姡珿C-MSCs與巨噬細胞之間的相互作用推進了胃癌發生、發展的進程，有望為臨床靶向治療提供更多的理論指導。

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