重組hfgl2-miRNA腺病毒在裸鼠人肝癌模型中的安全性初探*

王 鳴 劉君慧 習 東 寧 琴

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院感染免疫研究所 (湖北 武漢， 430030)

肝細胞癌(HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤患者的致死率中高居第三位[1]。我國是HCC高發(fā)國家，發(fā)病率占世界范圍的55%[2]。近年來腫瘤的基因治療逐漸受到重視，探索并設計針對性的靶向干預藥物，對新型腫瘤生物治療的開發(fā)具有重要意義。我們研究發(fā)現fgl2凝血酶原酶(fgl2)在肝癌細胞中高表達，瘤內注射針對人fgl2的微小RNA(hfgl2-miRNA)可顯著抑制腫瘤生長及腫瘤血管新生[3]。我們前期成功構建了腺病毒介導的重組人hfgl2-miRNA(Ad-hfgl2-miRNA)，體內外研究均證實對靶基因hfgl2具有顯著抑制作用。目前，有關Ad-hfgl2-miRNA的生物分布及安全性問題尚很少涉及，因此，我們采用瘤內注射Ad-hfgl2-miRNA，觀察其在裸鼠瘤內及非靶器官中的生物學分布，探討Ad-hfgl2-miRNA的體內安全性，為Ad-hfgl2-miRNA的進一步臨床研究做好鋪墊。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6～8周齡SPF級雄性BALB/c-nu裸鼠購自中國科學院上海實驗動物中心，體重20～22g，飼養(yǎng)于本研究所IVC(智能型獨立送回風凈化籠具)，恒溫恒濕條件下供應滅菌墊料、飼料、飲水。飼養(yǎng)1周左右開始實驗。試驗過程均需在無菌條件下執(zhí)行。實驗前將裸鼠隨機分為實驗組(Ad-hfgl2-miRNA)、陰性對照組(Ad-irrelevant-miRNA)，每組6只裸鼠，還有6只健康祼鼠作為空白對照組。

1.2 主要試劑 細胞培養(yǎng)基DMEM購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；SYBGREEN Mix購自日本TOYOBO公司；逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司。

1.3 病毒、引物及細胞 腺病毒Ad-hfgl2-miRNA由本研究所前期構建和保存，使用TCID50法測定Ad-hfgl2-miRNA的滴度，按109IU/只的病毒量進行實驗。PCR擴增所用引物由上海英駿生物技術有限公司合成；人高侵襲性肝癌細胞系HCCLM6購于復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所。

1.4 裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型建立 收集對數生長期的HCCLM6細胞，按1×106個/ml重懸細胞，選取祼鼠背部皮膚褶皺較多部位為注射點，按200μl/只接種細胞。術后每日觀察祼鼠皮下移植瘤生長情況，測量并計算腫瘤體積(公式為1/2×最長直徑×最短直徑2)，待皮下移植瘤體積>100mm3時行后續(xù)實驗。

1.5 給藥與取樣 按設定劑量，實驗組每只裸鼠注射Ad-hfgl2-miRNA 1×109IU，陰性對照組每只注射Ad-irrelevant-miRNA 1×109IU，瘤內多點注射。于給藥后第1、3、7、9、11、15、19、24天取裸鼠眼球血，并分別取出皮下移植瘤及心、肝、脾、肺、腎、小腸，液氮速凍，并保存于-80℃冰箱。空白對照組裸鼠僅末次取樣。

1.6 實時熒光定量PCR 分別取50mg腫瘤及各臟器組織，加入1ml Trizol(4℃預冷)，按說明書方法提取總RNA，檢測Ad-hfgl2-miRNA水平，引物序列為：上游引物5’-ACCAGCACAGTGTATCCG-3’，下游引物5’-CCAAGTTCTTCCACGCATT-3’，以GAPDH作為內參。反應條件如下：95°C預變性30s，95°C變性5s, 58°C退火5s，72°C延伸15s，40個循環(huán)。

1.7 生化指標檢測 取第1、3、7、11、24天裸鼠眼球血，離心取血清后送同濟醫(yī)院檢驗科，分別檢測谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶 (ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶L (LDH-L)等指標。

1.8 組織病理學檢測 注射Ad-hfgl2-miRNA 1×109IU后第1、3、7、11、24天取裸鼠心、肝組織，置4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，行HE染色，鏡下觀察病理學改變。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件分析熒光定量PCR數據，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Ad-hfgl2-miRNA在裸鼠人肝癌模型的體內分布及表達情況 見表1。hfgl2-miRNA在裸鼠心、肝、脾、肺、腎、瘤、小腸中均有表達，以心、肝、腎、荷瘤、小腸表達較強，可維持至給藥后第24天。其中，第3天肝臟hfgl2-miRNA水平為表達高峰，較陰性對照組明顯增高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。第3天與第7天的心、腎hfgl2-miRNA，表達較陰性對照組明顯增高，兩者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表達高峰出現在第7天。瘤組織、小腸hfgl2-miRNA水平，第7天為表達高峰，較陰性對照組明顯增高，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 3組小鼠生化指標檢測結果 見表2。注射Ad-hfgl2-miRNA后，各時間點的ALT、AST、CK、LDH-L、BUN、Cr均未見明顯異常或僅有輕度異常，組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 兩組裸鼠不同時間段Ad-hfgl2-miRNA在各臟器的表達量比較

與陰性對照組比較，*P<0.05

表2 3組祼鼠生化學指標檢測結果比較

2.3 實驗組裸鼠肝臟和心臟組織病理學變化 顯微鏡下可見肝臟和心臟組織輕微炎性細胞浸潤，未見明顯實質細胞損傷性改變(如：細胞大量壞死，明顯出血等)，見插頁圖1。

3 討論

作為一種新的凝血酶原酶分子，fgl2凝血酶原酶可直接促進凝血酶的生成而不依賴于其他凝血因子，凝血酶可通過降解纖維蛋白原形成纖維蛋白導致血栓形成和纖維素的沉積[4]。fgl2與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。我們的前期研究發(fā)現：常見實體腫瘤如肝癌、食管癌、肺癌、胃癌、結腸癌、宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的實質細胞、間質細胞、血管內皮細胞及細胞外基質均有fgl2凝血酶原酶的廣泛表達，并與纖維蛋白沉積有密切組織學關系[5]。作為凝血酶的上游基因，我們推測fgl2在腫瘤生長、轉移及血管新生中亦發(fā)揮了重要作用。我們應用裸鼠角膜血管新生模型和腫瘤皮下瘤移植模型顯示fgl2基因沉寂后的人肝癌細胞誘導血管新生的能力顯著降低；fgl2敲除的高侵襲性人肝癌細胞HCCLM6細胞增殖能力、侵襲能力，耐受TNFα誘導的凋亡能力、表達促血管生成因子如IL-8、VEGF的能力較未干擾HCCLM6細胞及非相關對照HCCLM6細胞均顯著下降，表明fgl2在腫瘤細胞中的高表達在腫瘤的生長和轉移中發(fā)揮了重要作用[6]。

基因治療是將具有治療價值的基因通過載體導入人體細胞中，直接進行表達，抑制、替代或補償缺陷基因，以達到防治或減輕疾病的目的。腺病毒載體是基因治療中最常用到的病毒載體，具有病毒滴度高、不整合到宿主基因組中、能夠感染分裂相和非分裂相細胞等優(yōu)點，這些優(yōu)點使得腺病毒載體成為最適合用于癌癥基因治療的載體。我們運用Ad-hfgl2-miRNA觀察其對裸鼠人肝癌皮下移植瘤的治療效果，結果顯示其可通過下調fgl2基因的表達而顯著抑制皮下移植瘤生長，同時也觀察到實驗組裸鼠腫瘤組織內新生血管數目減少[7]。目前，部分基于腺病毒載體的肝癌治療方案已進入臨床I 期或II期研究[8]，有望在現有治療水平的基礎上，進一步提高肝癌患者的生存質量，延長生存時間，為今后肝癌等惡性腫瘤的治療提供新思路。

作為臨床前研究的重要部分，研究藥物的生物分布及安全性對于觀察藥物是否能夠擴散到非靶器官，從而尋找毒性靶器官具有重要參考價值[9]。近年來，基因治療載體在體內的分布越來越受到重視。其中，對腺病毒載體的研究最為廣泛和深入。目前，最常用的檢測生物分布的方法是實時熒光定量PCR，其具有較高的靈敏性和特異性，不需要進行PCR 后續(xù)操作[10]。研究表明，給藥方式的不同其生物分布亦有差別。Huang D[11]等通過不同給藥途徑注射靶向CD40 的腺病毒，結果發(fā)現：通過靜脈給藥后腺病毒主要分布在肺部和淋巴結，通過皮內注射后腺病毒主要分布在引流淋巴結和皮膚，而通過鼻內給藥后腺病毒在肝臟和脾臟中均未檢測到。胡衛(wèi)[10]等通過瘤內注射重組腺病毒TOA02，發(fā)現腺病毒主要分布在瘤內、肝、腎、脾、肺、心臟，以瘤內最多。本研究同樣使用瘤內注射的方式，結果顯示腺病毒在心、肝、脾、肺、腎、瘤、小腸中均有表達，以心、肝、腎、荷瘤、小腸表達較強，與上述瘤內注射重組腺病毒TOA02的結果略有不同。腺病毒之所以分布于心、肝、腎、瘤等血供豐富的部位，可能是由于腺病毒主要與柯薩奇B病毒共用一種受體，即柯薩奇/腺病毒受體(CAR)[12]。CAR 分布廣泛， mCAR 分布于心、肝、腎、肺等組織，且在肝臟中表達量最高。這種組織內的廣泛分布通常是短暫的，待病毒含量下降后，各組織的病毒也會隨之被清除。腺病毒載體的這一特點對某些僅需要外源基因短暫表達的基因治療是有利的,基因的持續(xù)表達可能會引起機體功能紊亂和毒副作用的出現。

盡管基因治療目前還處于起步階段，在目的基因有效性及作用持久性、載體的靶向性和基因轉移系統(tǒng)的可控性等方面存在一系列有待解決的問題，但可以預見，只要堅持嚴格的科學態(tài)度,設計精細的臨床研究，基因治療離人們將越來越近。

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