常山酮通過CD14/NF-κB通路調控LPS誘導的大鼠急性肺損傷免疫系統紊亂①

章小山

(河南省南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院，南陽 473000 )

急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是由感染、創傷、休克等原因引起的以呼吸窘迫和低氧血癥為特征的臨床綜合征[1]。現代研究表明，免疫系統紊亂引起的血-氣屏障破壞和肺水腫是導致呼吸窘迫的主要原因[2]。同時，炎癥反應在ALI發生和急劇惡化的過程中發揮著重要作用[3-5]。因此，有效調控免疫系統紊亂、抑制炎癥反應是治療ALI的關鍵。常山酮(Halofuginone,HF，圖1)是中藥常山的主要活性成分[6]。現代研究表明，HF具有較強的免疫調節功能，能夠減輕多種疾病的炎癥反應，抑制細胞凋亡[7-9]。但HF是否能夠調控脂多糖(Lipopolysa-ccharide,LPS)誘導的ALI免疫系統紊亂還未見報道。因此，本文將通過復制大鼠ALI模型，探討HF對大鼠ALI的作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 LPS購自美國Sigma公司，HF購自中國上海晶都生物科技公司。流式細胞儀購自美國ThermoFisher公司。白介素-1 beta(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6和IL-18 ELISA試劑盒購自美國Millipore公司。CD14、Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和核轉錄因子-κB p65(Nuclear factor of kappa B p56,NF-κB p65)一抗均購自美國Sigma公司，二抗購自美國Proteintech公司。

1.2方法

1.2.1復制大鼠ALI模型 參照文獻[10]報道的方法復制大鼠ALI模型。雄性Wistar大鼠購自北京實驗動物中心。將大鼠適應性飼養3 d后將其隨機分為正常對照組、LPS組、LPS+HF (1 mg/kg BW)組、LPS+HF (5 mg/kg BW)組和LPS+HF (10 mg/kg BW)組。實驗前12 h禁食不禁水。除正常對照組外，其余各組大鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg，正常對照組則腹腔注射等量的生理鹽水。隨后各受試物組大鼠即刻腹腔注射給予不同濃度的HF，連續7 d，對照組和LPS組給予等量溶媒。7 d后處死大鼠，取肺進行后續實驗。

1.2.2蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,HE)染色 制作大鼠肺冰凍切片。用PBS清洗3次后，將冰凍切片放入蘇木精溶液中染色5 min，于1%鹽酸乙醇液中褪色。用自來水沖洗后，用乙醇進行梯度脫水。隨后滴加0.5%伊紅復染，無水乙醇脫水。最后用二甲苯透明，封片，于顯微鏡下觀察記錄。

1.2.3TUNEL檢測凋亡小體 制作大鼠肺組織冰凍切片。用4%多聚甲醛室溫固定組織切片 30 min，滴加0.5% TritonX-100透膜15 min。用2%H2O2室溫封閉10 min后，加入TUNEL溶液37℃孵育 1 h，最后滴加DAB染色液復染10 min，于顯微鏡下每片隨機選取5個視野進行統計分析。

1.2.4ELISA 用組織勻漿機將大鼠肺組織勻漿后，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，根據ELISA試劑盒說明書檢測上清液中IL-1β、IL-18和IL-6的含量。

1.2.5流式細胞術 給予受試物7 d后，用10%多聚甲醛麻醉大鼠，心臟取血，并加入肝素抗凝。將獲得的血液用Ficoll溶液進行梯度離心獲得單核細胞，加入CD14抗體室溫孵育30 min，用染色緩沖液終止染色，并離心重懸細胞，將細胞密度調整至1×107個/ml，用流式細胞儀進行分選。

1.2.6Western blot 將所獲得的肺組織剪碎至1 mm3，用組織裂解液提取各組大鼠組織總蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度后，將各組蛋白濃度調平。用SDS-PAGE分離組織蛋白并轉移蛋白至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h，加入適當濃度的一抗(CD14,1∶1 100;TLR4,1∶1 000;NF-κB p65,1∶800)4℃封閉過夜。次日棄去一抗，用TBST清洗3次后，加入對應二抗室溫孵育1 h，滴加ECL顯色液進行曝光顯影。

2 結果

2.1HF對ALI大鼠肺病理損傷的影響 為了探究HF對LPS誘導的ALI大鼠肺損傷的作用，我們用HE染色法檢測了肺組織病理變化情況。如圖1B所示，與正常對照組比較，LPS組肺泡腔內可見大量炎性細胞滲出，病灶內肺泡萎陷，肺纖維化程度加重；與LPS組比較，LPS+HF (1 mg/kg SW)組、LPS+HF (5 mg/kg SW)組和LPS+HF (10 mg/kg SW)組肺泡腔內炎性細胞減少，肺泡壁變薄，肺纖維化程度減輕，并呈現出量效關系。

2.2HF對ALI大鼠肺細胞凋亡的影響 為了探究HF對ALI大鼠肺細胞凋亡的影響，我們用TUNEL法檢測了凋亡小體的形成情況。實驗結果表明，LPS可誘導肺組織凋亡小體的形成(P<0.05，圖2)；HF能顯著抑制LPS誘導的凋亡小體形成，并隨劑量的增大，作用逐漸增強(P<0.05，圖2)。

2.3HF對ALI大鼠炎癥反應的影響 ELISA實驗結果表明，與正常對照組比較，LPS組肺組織炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-18的含量明顯增多(P<0.05，圖3)；與LPS組比較，各受試物組大鼠肺組織IL-1β、IL-6和IL-18的含量明顯減少(P<0.05，圖3)，并呈現出量效關系。

圖1 HF對ALI大鼠肺病理損傷的影響Fig.1 Influence of HF on pulmonary injury in ALI ratsNote: A.The chemical structure of HF;B.Rats were injected with LPS and followed with HF for 7 days.The pathological lesion was measured by HE staining.

圖2 HF對ALI大鼠肺細胞凋亡的影響Fig.2 Influence of HF on apoptosis in lungNote: The apoptosis was calculated by TUNEL assay,*.P<0.05 vs healthy control，#.P<0.05 vs LPS.

圖3 HF對ALI大鼠炎癥反應的影響Fig.3 Influence of HF on inflammation in ALI ratsNote: The levels of IL-1β，IL-6 and IL-18 in lung tissue were measured by ELISA kits.*.P<0.05 vs Healthy control；#.P<0.05 vs LPS.

圖4 HF對ALI大鼠外周血CD14表達的影響Fig.4 The influence of HF on CD14+ cells in bloodNote: A.The CD14+ cells were selected by fluorescence-activated cell sorting;B.Quantification of Fig.4A.*.P<0.05 vs Healthy control，#.P<0.05 vs LPS.

2.4HF對ALI大鼠外周血CD14表達的影響 CD14是LPS共受體，能與LPS結合誘導炎癥反應[11]。實驗結果表明，LPS能顯著誘導CD14在ALI大鼠外周血單核細胞中的表達(P<0.05，圖4)；HF可明顯減少ALI大鼠外周血中CD14+細胞數(P<0.05，圖4)，并呈現量效關系。

圖5 HF對CD14/NF-κB信號通路的影響Fig.5 Influence of HF on CD14/NF-κB signa-ling pathwayNote: A.The protein levels of CD14，TLR4 and NF-κB p56 were measured by western blot；B.Quantification of Fig.5A.*.P<0.05 vs Healthy control，#.P<0.05 vs LPS,GAPDH was used as loading control.

2.5HF對CD14/NF-κB信號通路的影響 為了探討HF調控ALI免疫系統紊亂的作用機制，我們檢測了CD14/NF-κB信號通路蛋白的表達情況。實驗結果表明，與正常對照組比較，LPS組CD14、TLR4和NF-κB p65的表達水平明顯升高(P<0.05，圖5)；與LPS組比較，LPS+HF (1 mg/kg BW)組TLR4和NF-κB p65的表達水平明顯降低(P<0.05，圖5)；LPS+HF (5 mg/kg BW)組和LPS+HF(10 mg/kg BW)組CD14、TLR4和NF-κB p65的表達水平也均明顯降低(P<0.05，圖5)，且具有量效關系。

3 討論

常山是草本植物常山的干燥根，中醫常用其治療痰飲停聚、胸膈痞塞和瘧疾[12]。HF是常山的主要活性成分之一，現代研究發現HF具有抗炎、免疫調節、抗癌等藥理學活性[8,13,14]。HF可通過調控Th17和Treg細胞之間的平衡緩解自身免疫性關節炎的發展，表明其具有較強的免疫調節功能[8]。大量研究表明，HF可通過抑制TGF-β的表達和膠原蛋白的合成抑制肺纖維化[15-17]。Calik等[18]發現，HF可明顯改善輻射誘導的ALI，減輕肺組織炎性細胞的浸潤及肺纖維化。本文研究表明，HF可明顯改善LPS誘導的ALI，可減輕炎性細胞浸潤及肺纖維化程度、改善肺泡結構。同時，HF還可明顯減弱LPS誘導凋亡小體形成的作用，表明其可通過減輕肺纖維化、抑制細胞凋亡發揮肺保護作用。

炎癥反應是ALI的主要病理表現，也是導致ALI惡化的主要原因[3]。ALI可由多種原因誘發，如內毒素、酸中毒、補體激活等[1]。LPS是內毒素的主要組成部分，是導致肺損傷最常見的原因之一[19]。LPS可導致肺組織炎性細胞浸潤，誘導大量促炎癥因子的釋放而誘發肺組織的炎癥反應，從而導致細胞凋亡[20，21]。IL-1β、IL-18和IL-6等是ALI炎性過程的主要特征因子，其參與了ALI炎癥反應的整個過程[7,22]。其中，IL-1β可促進IL-6、IL-18的生成[23]。IL-6可誘導黏附分子和其他炎癥因子的表達，還能促進巨噬細胞的分化和浸潤[24]。研究表明，IL-1β、IL-18和IL-6在ALI中表達明顯增多[25-27]。HF具有較強的抗炎活性，可抑制TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達[7,22]。Sun等[9]研究發現，HF可通過調控IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α等前炎癥因子的表達影響病毒性心肌炎的發展。本文研究發現，HF可明顯抑制LPS誘導的ALI炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-18的表達，并隨濃度升高，作用逐漸增強，表明其能夠對抗ALI炎癥反應，從而抑制肺細胞的凋亡。

CD14是位于巨噬細胞和單核細胞上的LPS共受體，LPS誘導炎癥反應依賴于與CD14的結合[11]。本文研究發現，HF能明顯抑制LPS誘導的CD14表達，并具有量效關系，表明其可能是通過減弱LPS與CD14結合抑制下游炎癥反應相關通路的激活。CD14分為可溶性CD14和膜結合CD14兩種類型[28]。研究表明，CD14與LPS結合后可將LPS傳遞給TLR4使其活化，活化的TLR4又激活TLR/MyD88從而誘導NF-κB p65激活，使其轉移至細胞核，并與DNA結合，從而促進IL-1β、IL-18和IL-6等炎癥因子的表達，誘導炎癥反應發生[5,29-31]。已有研究表明，LPS誘導ALI與調控其下游CD14/NF-κB信號通路有關[32,33]，但HF調控LPS誘導的ALI免疫系統紊亂是否與CD14/NF-κB信號通路有關還未見報道。LPS明顯上調了ALI大鼠肺組織CD14和TLR4的表達水平，并促進肺細胞核蛋白NF-κB p65的表達，其中，NF-κB p65是NF-κB的一個重要亞型，其轉移入核是調控NF-κB活化的關鍵[34]。結合實驗結果表明LPS可激活CD14/NF-κB信號通路。同時，HF可顯著降低CD14、TLR4和NF-κB p65的蛋白表達水平，表明其可抑制LPS誘導的CD14/NF-κB通路的激活，并且HF可能通過調控CD14/NF-κB信號通路抑制ALI大鼠的炎癥反應及肺細胞的凋亡。

綜上所述，HF可通過抑制炎癥因子IL-1β、IL-18和IL-6的釋放明顯改善LPS誘導的ALI大鼠肺組織的病變，抑制肺纖維化及細胞凋亡，并且其機制與抑制CD14/NF-κB信號通路激活有關。本文可能為ALI的治療提供了一種新的潛力藥物，但HF對ALI其他病理環節的作用還有待進一步探討。

參考文獻：

[1] Ather JL,Alcorn JF,Brown AL,etal.Distinct functions of airway epithelial nuclear factor-kappaB activity regulate nitrogen dioxide-induced acute lung injury[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2010,43(4):443-451.

[2] Matthay MA,Ware LB,Zimmerman GA.The acute respiratory distress syndrome[J].J Clin Invest，2012,122(8):2731-2740.

[3] Lin WC,Chen CW,Huang YW,etal.Kallistatin protects against sepsis-related acute lung injury via inhibiting inflammation and apoptosis[J].Sci Rep，2015,22(5):12463.

[4] Thangavel J,Samanta S,Rajasingh S,etal.Epigenetic modifiers reduce inflammation and modulate macrophage phenotype during endotoxemia-induced acute lung injury[J].J Cell Sci，2015,128(16):3094-3105.

[5] Tianzhu Z,Shumin W.Esculin inhibits the inflammation of LPS-induced acute lung injury in mice via regulation of TLR/NF-κB pathways[J].Inflammation,2015,38(4):1529-1536.

[6] Chen GQ,Gong RH,Yang DJ,etal.Halofuginone dually regulates autophagic flux through nutrient-sensing pathways in colorectal cancer[J].Cell Death Dis,2017,8(5):e2789.

[7] Liu J,Xiao HT,Wang HS,etal.Halofuginone reduces the inflammatory responses of DSS-induced colitis through metabolic reprogramming[J].Mol Biosyst,2016,12(7):2296-2303.

[8] Park MK,Park JS,Park EM,etal.Halofuginone ameliorates autoimmune arthritis in mice by regulating the balance between Th17 and Treg cells and inhibiting osteoclastogenesis[J].Arthritis Rheumatol,2014,66(5):1195-1207.

[9] Sun XH,Fu J,Sun DQ.Halofuginone alleviates acute viral myocarditis in suckling BALB/c mice by inhibiting TGF-β1[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,473(2):558-564.

[10] Wang YY,Qiu XG,Ren HL.Inhibition of acute lung injury by rubriflordilactone in LPS-induced rat model through suppression of inflammatory factor expression[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(12):15954-15959.

[11] Fenton MJ,Golenbock DT.LPS-binding proteins and receptors[J].J Leukoc Biol,1998,64(1):25-32.

[12] Huo S,Yu H,Li C,etal.Effect of halofuginone on the inhibition of proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma HepG2 cell line[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(12):15863-15830.

[13] Chen GQ,Tang CF,Shi XK,etal.Halofuginone inhibits colorectal cancer growth through suppression of Akt/mTORC1 signaling and glucose metabolism[J].Oncotarget,2015,6(27):24148-24162.

[14] Carlson TJ,Pellerin A,Djuretic IM,etal.Halofuginone-induced amino acid starvation regulates Stat3-dependent Th17 effector function and reduces established autoimmune inflammation[J].J Immunol,2014,192(5):2167-2176.

[15] Nagler A,Firman N,Feferman R,etal.Reduction in pulmonary fibrosis in vivo by halofuginone[J].Am J RespirCrit Care Med,1996,154(4):1082-1086.

[16] Yavas G,Calik M,Calik G,etal.The effect of Halofuginone in the amelioration of radiation induced-lung fibrosis[J].Medical Hypotheses,2013,80(4):357-359.

[17] Pines M,Nagler A.Halofuginone:a novel antifibrotictherapy[J].Gen Pharmacol,1998,30(4):445-450.

[18] Calik M,Yavas G,Calik SG,etal.Amelioration of radiation-induced lung injury by halofuginone:An experimental study in Wistar-Albino rats[J].Hum Exp Toxicol,2017,36(6):638-647.

[19] Dong IK,Kim SR,Kim HJ,etal.PI3K-γ Inhibition ameliorates acute lung injury through regulation of IκBα/NF-κB pathway and innate immune responses[J].J Clin Immunol,2012,32(2):340-351.

[20] Rossol M,Heine H,Meusch U,etal.LPS-induced cytokine production in human monocytes and macrophages[J].Crit Rev Immunol,2011,31(5):379-446.

[21] 倪敬琴,歐陽秋芳,黃子揚,等.TLR4受體在LPS誘導的ApoE-/-小鼠急性肺損傷中的意義[J].中國免疫學雜志,2013,29(9):930-934.

Ni JQ,Ouyang QF,Huang ZY,etal.TLR4 receptor in LPS induced ApoE-/-the significance of acute lung injury in mice[J].Chin J Immunol,2013,29(9)：930-934.

[22] Liang J,Zhang B,Shen RW,etal.Preventive effect of halofuginone on concanavalin A-induced liver fibrosis[J].PloS One,2013,8(12):e82232.

[23] Ito Y,Kaneko N,Iwasaki T,etal.IL-1 as a target in inflammation[J].Endocr Metab Immune Disord Drug Targets,2015,15(3):206-211.

[24] Tanaka T,Narazaki M,Kishimoto T.IL-6 in inflammation,immunity,and disease[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2014,6(10):a016295.

[25] Chen X,Wan Y,Zhou T,etal.Ursolic acid attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in a mouse model[J].Immunotherapy,2013,5(1):39-47.

[26] Bai GZ,Yu HT,Ni YF,etal.Shikonin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice[J].J Surg Res,2013,182(2):303-311.

[27] Zhang T,Yang S,Du J.The effects of morin on lipopolysaccharide-induced acute lung injury by suppressing the lung NLRP3 inflammasome[J].Inflammation,2014,37(6):1976-1983.

[28] Pugin J,Schürer-Maly CC,Leturcq D,etal.Lipopolysaccharide activation of human endothelial and epithelial cells is mediated by lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD14[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1993,90(7):2744-2748.

[29] Liu H,Chen K,Feng W,etal.TLR4-MyD88/Mal-NF-kB axis is involved in infection of HSV-2 in human cervical epithelial cells[J].PLoS One,2013,8(11):e80327.

[30] Tasaka S,Ishizaka A,Yamada W,etal.Effect of CD14 blockade on endotoxin-induced acute lung injury in mice[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2003,29(2):252-258.

[31] Ma L,Wu XY,Zhang LH,etal.Propofol exerts anti-inflammatory effects in rats withlipopolysaccharide-induced acute lung injury by inhibition of CD14 and TLR4expression[J].Braz J Med Biol Res,2013,46(3):299-305.

[32] Jeyaseelan S,Hong WC,Young SK,etal.Distinct roles of pattern recognition receptors CD14 and Toll-like receptor 4 in acute lung injury[J].Infect Immun,2005,73(3):1754-1763.

[33] Phan HH,Cho K,Sainz-Lyon KS,etal.CD14-dependent modulation of NF-kappaB alternative splicing in the lung after burn injury[J].Gene,2006,371(1):121-129.

[34] Maguire O,O′Loughlin K,Minderman H.Simultaneous assessment of NF-κB/p65 phosphorylation and nuclear localization using imaging flow cytometry[J].J Immunol Methods,2015,423:3-11.