MaASR1基因通過乙烯途徑提高擬南芥抗旱性的作用機制

張麗麗， 徐碧玉， 劉菊華， 賈彩紅， 張建斌， 金志強,2

(1.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室,海南 海口 571101； 2.中國熱帶農業科學院海口實驗站/海南省香蕉遺傳育種改良重點實驗室,海南 海口 570102)

環境的非生物脅迫，如干旱，極端溫度，寒冷，重金屬，或高鹽，嚴重損害植物生長和生產力。干旱是最嚴重的環境脅迫，超過任何其他環境因素，嚴重損害植物的生長和發育，限制植物生產和作物的性能[1]。植物激素，如脫落酸(ABA)、乙烯(ET)、水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)對植物的生長和發育有廣泛的影響，它們調節植物抵御生物和非生物脅迫的保護性應答[2-6]。不同的非生物脅迫和生物脅迫，經常通過共享或重疊激素信號轉導通路來引發植物響應[7-8]。

乙烯在試驗中被證明可以關閉氣孔[9]，環境誘導乙烯積累可以導致氣孔關閉也已經被報道[10]。乙烯應答因子ERF類蛋白在植物生長發育尤其是在植物應對非生物脅迫中起著非常重要的作用[11-12]。在早期的研究中發現來自番茄的乙烯應答因子蛋白JERF3 通過調節氧化脅迫應答來增強轉基因煙草對干旱、鹽和冷害的耐受力[13]。JERF1和JERF3基因在轉基因水稻中的過量表達會引起一系列生理和分子的變化，從而增強水稻對干旱和氧化脅迫的耐受力[14]。植物對環境脅迫的適應依賴于參與脅迫感知、信號轉導、及特定脅迫和代謝相關基因表達的分子網絡的激活[15]。研究結果表明番茄SlERF5在擬南芥對生物和非生物脅迫的轉錄調控中發揮著重要作用[16]。SlERF5基因在番茄中的過量表達會增強番茄對干旱和高鹽脅迫的耐受力[17]。油菜乙烯應答因子BrERF4在擬南芥中的過量表達可以增強擬南芥對干旱和鹽的耐受力[18]。擬南芥ERF022可以通過乙烯途徑調節體細胞胚胎發生的誘導[19]，擬南芥ERF1通過結合不同的順式作用元件來調節非生物脅迫應答基因的表達[20]。OsEF109可以顯著提高水稻對干旱脅迫的耐受性[21],OsERF3的過表達改變了對乙烯生物合成的調控，揭示了乙烯對植株耐旱性的正調節作用[22]。

此外有一些ERF類蛋白在植物響應脅迫時發揮負調控的作用，比如擬南芥AtERF4和AtERF7作為轉錄抑制因子來調控ABA的應答[23-24]。AtERF7在擬南芥中的過量表達可以使保衛細胞降低對ABA的敏感性，因此通過氣孔增加了水分的損失，AtERF7在擬南芥中的過量表達甚至抑制被ABA誘導的基因的表達從而降低了對干旱脅迫的耐受力[23]。AtERF4與AtERF7發揮調控作用的原理相似，它可以增強植物對鹽脅迫的敏感性[24]。

MaASR1是從香蕉果實的cDNA文庫中獲得的一個ASR基因，本實驗室前期的研究結果表明香蕉植株在干旱脅迫條件下，MaASR1基因在根部和葉片中的表達量大幅上升，這說明MaASR1基因主要參與植物在面臨干旱脅迫時的應答反應[25]。為了深入研究MaASR1基因在香蕉干旱脅迫中發揮作用的抗性機制，將MaASR1基因轉入模式植物擬南芥，獲得了轉基因純合株系L14[25]。L14在干旱脅迫條件下的存活率優于野生型擬南芥植株[25]。并且在轉基因株系中，MaASR1基因的表達量越大，則該株系表現出來的抗旱能力則越強[25-26]。這些證據都能說明MaASR1基因的轉入能夠提高擬南芥的抗旱性[25]。為了進一步研究MaASR1基因轉入擬南芥后增強其抗旱性的分子機制，運用DNA芯片技術來篩選野生型擬南芥和轉MaASR1基因擬南芥在不做任何處理和干旱脅迫處理條件下的差異基因，希望能進一步解析香蕉MaASR1基因通過乙烯途徑提高擬南芥抗旱性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana. Columbia ecotype)是從美國俄亥俄州立大學擬南芥生物資源中心購買的。轉MaASR1基因的轉基因型擬南芥命名為L14，是由本實驗室構建植物表達載體后通過農桿菌侵染的方法轉化得到的。

1.2 所用引物

本研究所用引物見表1。

1.3 試驗方法

1.3.1 對野生型和MaASR1轉基因擬南芥幼苗的干旱處理 在MS固體培養基上播種野生型擬南芥WT和MaASR1轉基因株系L14的種子，4 ℃條件下處理3 d (該步驟主要是對種子進行春化處理)，然后在光照培養箱中培養。溫度為 21～23 ℃，每日光照和黑暗培養時間分別為8 h和16 h。光照度為2 000 lx，相對濕度為70%。15 d后，選擇生長出 2～4片葉片的幼苗，將其從培養皿中取出，置于蓋有2個培養皿的濾紙之上，然后在光照培養箱中模擬干旱脅迫條件進行處理。處理時間分別為0 h、2 h和6 h，然后分別取樣0.2 g，擬南芥的取樣部位為整個擬南芥幼苗植株，在液氮中冷凍之后于-70 ℃保存[25]。

表1 本研究所用引物

1.3.2 野生型和MaASR1轉基因擬南芥葉片總RNA的提取及cDNA的合成 取干旱處理0 h、2 h和6 h的試驗材料，用QIAGEN plant RNA Kit試劑盒來提取擬南芥的總RNA。然后用Fermentas的反轉錄試劑盒合成cDNA的第1條鏈。熒光定量PCR的引物序列見表1，qRT-PCR儀器型號為Mx3000P(Stratagene，USA)，以擬南芥看家基因AtActin(基因登錄號AK318637)為內參基因。熒光定量PCR程序為94 ℃，30 s；94 ℃ 7 s，55 ℃(57 ℃) 15 s，72 ℃ 20 s,40個循環。

1.3.3 熒光定量PCR數據分析 數據處理采用Excel 2010軟件完成，利用DPS軟件對數據進行統計分析,差異顯著性檢驗和相關性分析。

1.3.4 表達譜芯片的制作和分析 提取MaASR1轉基因株系(編號為L14)和野生型擬南芥的總RNA，委托博奧生物有限公司制作2種類型的表達譜芯片，一種是轉基因與野生型擬南芥在自然狀態即未作任何脅迫處理條件下的DNA芯片，命名為14 vs WT，其中14代表非脅迫處理下轉基因株系L14，WT代表非脅迫處理下野生型擬南芥；另一種是干旱處理2 h的MaASR1轉基因擬南芥L14與野生型表達譜芯片，命名為Y vs W，其中Y代表干旱脅迫處理下轉基因株系L14，W代表干旱脅迫處理下野生型擬南芥。2種類型的芯片各重復3次以減少誤差。并對所得到的DNA芯片的結果進行生物信息學分析和差異基因的篩選。

2 結果與分析

2.1 表達譜芯片差異基因的通路分析

表達譜芯片的篩選標準為：Ratio≥2代表表達上調大于2倍的基因，Ratio≤0.5代表表達下調大于2倍的基因。14 vs WT一共得到747個差異基因，其中上調基因559個，下調基因188個；Y vs W一共得到653個差異基因，其中上調基因256個，下調基因397個[27]。

在14 vs WT芯片中得到的差異基因經分析共找到61個相關的pathway，主要涉及淀粉和蔗糖的代謝，磷酸戊糖途徑，糖酵解及糖異生，植物激素信號轉導等途徑。共有9個差異基因參與激素信號轉導途徑(表2)，其中8個差異基因上調，1個差異基因下調。

在Y vs W芯片中得到的差異基因經分析共找到58個相關的pathway，主要涉及植物激素信號轉導，光合作用，葉綠素代謝，植物生長節律等代謝途徑。共有20個差異基因參與激素信號轉導途徑(表3)，其中5個差異基因上調，15個差異基因下調。

表2 14 vs WT芯片中差異基因的通路分析

表3 Y vs W芯片中差異基因的通路分析

通過對表達譜芯片進行詳細的生物信息學分析(主要包括Network分析，Gene ontology分析以及Pathway分析)，發現MaASR1基因提高植物抗旱性與植物激素信號轉導途徑有密切的關系。本研究重點研究了與乙烯途徑的關系，經分析得到了與乙烯途徑相關的幾個關鍵基因，分別是：ACO1(ACC OXIDASE 1)，即ACC氧化酶基因；ACS6(1-AMINOCYCLOPROPANE-1- CARBOXYLIC ACID (ACC) SYNTHASE 6)，即ACC合成酶基因；AtERF4(ETHYLENE RESPONSIVE ELEMENT BINDING FACTOR)，即乙烯應答元件結合因子基因；AtERF5、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13、AtETR2(ETHYLENE RESPONSE 2)，即乙烯受體基因；AtERS2(ETHYLENE RESPONSE SENSOR 2)，即乙烯反應傳感蛋白基因；AtEBF2(EIN3-BINDING F BOX PROTEIN 2)，即結合AtEIN3的F-box蛋白基因；At5g61600(ethylene-responsive element-binding family protein)，即乙烯響應結合元件家族蛋白基因[27]。

2.2 表達譜芯片中野生型及MaASR1轉基因擬南芥乙烯應答相關基因的表達

ACS6與ACO1參與乙烯生物合成過程，AtERF4、AtERF5、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13乙烯應答元件結合因子，從AtERF4～AtERF11都參與乙烯介導的信號途徑。利用Real-time RT-PCR檢測野生型及MaASR1轉基因擬南芥不同時間的干旱處理及在不做任何脅迫處理條件下乙烯相關基因的表達變化，來進行芯片結果的驗證。

如圖1所示，參與乙烯生物合成途徑的AtACS6和AtACO1，MaASR1轉基因擬南芥在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h時的基因表達量均高于野生型，而在干旱脅迫6 h時野生型擬南芥基因的表達量則明顯高于MaASR1轉基因擬南芥。

參與乙烯信號途徑的ERF類基因，AtERF6、AtERF11和AtERF13基因變化趨勢相同，MaASR1轉基因擬南芥在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h、6 h時的基因表達量均高于野生型；AtERF5和AtERF8基因變化趨勢相同，在未受干旱脅迫時MaASR1轉基因擬南芥的基因表達量明顯高于野生型，在干旱脅迫2 h時MaASR1轉基因擬南芥與野生型基因表達量基本相同，而在干旱脅迫6 h時野生型擬南芥基因表達量明顯高于轉基因擬南芥；AtERF4基因變化趨勢與前兩類均不同，在未受干旱脅迫處理時，轉基因擬南芥基因表達量與野生型差異不顯著，而在干旱脅迫2 h和6 h時，轉基因擬南芥基因表達量則明顯高于野生型。

乙烯受體基因AtETR2和AtERS2在未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h和6 h時，MaASR1轉基因擬南芥基因表達量都高于野生型。

未受干旱脅迫時AtEBF2在MaASR1轉基因擬南芥中的基因表達量明顯高于野生型。干旱脅迫2 h和6 h時的基因表達量在MaASR1轉基因擬南芥和野生型中沒有顯著差異。

未受干旱脅迫和干旱脅迫2 h時，乙烯響應結合元件家族蛋白At5g61600在MaASR1轉基因擬南芥中的表達量均高于野生型，在干旱脅迫6 h時MaASR1轉基因擬南芥表達量低于野生型，達到了極顯著差異。

從表4中芯片檢測數據與Realtime-PCR數據之間相關性分析可以看出，相關系數均大于0.7，這說明芯片檢測數據與Realtime-PCR數據是極顯著正相關的關系，說明得到的芯片數據是可靠的。

3 討 論

AtACS6即ACC合成酶，是整個乙烯合成途徑中的關鍵酶和限速酶，SAM在ACC合酶(ACC synthase,ACS)的催化下產生氨基環丙烷羧酸(1-aminocyclo- propane-1-carboxylic acid, ACC)，ACC在AtACO1即ACC氧化酶的催化下產生乙烯。RT-PCR結果表明，在干旱脅迫2 h時，AtACS6和AtACO1在MaASR1轉基因株系的表達水平與野生型相比明顯提高。這表明在干旱脅迫條件下，MaASR1的轉入提高了擬南芥體內的乙烯合成水平。

在植物的乙烯反應途徑中，第一步是乙烯與受體分子相結合。在擬南芥中共有5個乙烯受體，它們表現出功能冗余。多種乙烯受體的存在是乙烯反應順利進行所必需的，即使其中的一個受體功能喪失了或者發生了突變，乙烯反應也不受影響。乙烯受體對乙烯反應起負調控作用，擬南芥中乙烯反應的誘導是由于這些蛋白質的失活而不是激活[28]。受體本身處于開啟狀態，抑制乙烯反應，乙烯與受體的結合使受體關閉[29]。乙烯缺乏時，乙烯受體與CTRI結合，形成ETR-CTRI復合體，激活CTRI的負調控活性, 不產生乙烯反應；乙烯存在時，乙烯與受體結合，CTRI不能被激活，產生乙烯反應。乙烯受體和CTRI都是乙烯信號轉導的負調控器，乙烯與受體結合鈍化其負調控活性[30]。位于乙烯信號轉導下游和末端的EIN2、EIN3和ERF1都是乙烯信號轉導的正調控器[31]。EBF2即結合EIN3的F-box蛋白，EBF1/ EBF2通過一條泛蛋白/蛋白酶體途徑作用于EIN3蛋白，使EIN3蛋白迅速降解。說明EBF1/ EBF2間接對乙烯反應起負調控作用[32]。

不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)。圖1 野生型及MaASR1轉基因擬南芥乙烯應答相關基因表達的Realtime-PCR驗證Fig.1 The expression profile of ethylene related genes detected by Realtime-PCR in wild-type and the MaASR1 transgenic line L14

表4 芯片數據與熒光定量PCR結果的相關性

ERFs 類的轉錄因子在植物對非生物脅迫的應答中發揮重要作用。ERF轉錄因子可以與順式作用元件DRE/CRT結合，而DRE/CRT廣泛存在于與植物對干旱、冷害和鹽害等非生物脅迫等密切相關的功能基因的啟動子中。ERF轉錄因子可以通過識別順式作用元件DRE/CRT調節脅迫相關基因的表達，從而調節植物對非生物脅迫的應答反應。水稻中ERFs轉錄因子TSRF1的過量表達可以提高水稻的抗旱性[33]；在水稻中克隆和鑒定了4個ERF類轉錄因子OsBIERF1～OsBIERF4，它們都參與植物對非生物脅迫的應答[34]。可溶性糖和脯氨酸是參與植物滲透調節的關鍵因素，它們可以增強植物對環境脅迫的適應能力[35-36]。JERF3基因在水稻中的過量表達能提高在干旱脅迫下可溶性糖和脯氨酸的積累水平從而抵御干旱[37]。

以上研究結果都表明，ERFs 轉錄因子在植物的非生物脅迫應答中具有非常重要的作用。從表達譜芯片的分析結果和RT-PCR的結果顯示，在2 h干旱脅迫條件下AtERF4、AtERF6、AtERF8、AtERF11、AtERF13的表達量在轉基因擬南芥中比野生型有明顯的提高，其中AtERF8的表達量在轉基因擬南芥中與野生型相比差異顯著，AtERF4、AtERF6、AtERF11、AtERF13的表達量在轉基因擬南芥中與野生型相比差異極顯著。在2 h干旱脅迫條件下，AtERF5的表達在野生型和轉基因型中沒有明顯變化；但在未進行干旱脅迫時AtERF5的表達量在轉基因擬南芥中比野生型有明顯的提高，差異極顯著。以上結果表明MaASR1可以通過提高AtERF類基因的表達來賦予擬南芥植物抗旱性。在干旱脅迫條件下AtETR2和AtERS2的表達量在轉基因擬南芥中比野生型有所提高，由于乙烯受體有功能冗余，所以乙烯受體AtETR2和AtERS2表達量的變化不會影響最后的乙烯反應。在干旱脅迫2 h時，乙烯負調控因子AtEBF2的表達量在轉基因擬南芥中與野生型沒有明顯差異，在干旱脅迫6 h時，AtEBF2的表達量在轉基因擬南芥中比野生型明顯下降，因此是有利于乙烯反應的進行。在干旱脅迫2 h時，乙烯應答蛋白基因At5g61600在轉基因擬南芥中的表達量比野生型顯著提高。

目前尚沒有AtASR基因通過調節乙烯途徑來提高植物抗旱性的報道，以上芯片生物信息學分析以及RT-PCR的研究結果表明，MaASR1基因可以通過正調控乙烯反應和提高AtERF類基因的表達來賦予植物抗旱性。并且在干旱脅迫條件下，MaASR1的轉入通過提高AtACS6和AtACO1的表達水平提高了擬南芥體內的乙烯合成水平，這為深入解析MaASR1基因提高植物抗旱性的作用機理奠定了基礎。

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