頭花蓼水浸提液的化感自毒作用

劉 勇， 劉 燕， 胡茂飛， 趙許朋， 楊 丹

(1.貴陽學院生物與環境工程學院，貴州 貴陽 550005； 2.中國科學院地球化學研究所環境地球化學國家重點實驗室，貴州 貴陽 550002； 3.中國科學院大學，北京 100049)

作物連作障礙是影響農業可持續發展的重要因素[1-2]。土壤理化性質惡化、作物根結線蟲、傳染性病害以及作物根系分泌物和殘茬分解物的化感自毒作用等均能導致連作障礙[3-7]。其中化感自毒作用(Allelopathic autotoxicity)即作物根系分泌物、莖、葉等淋溶物和殘茬腐解物(一些次生代謝產物)對自身細胞膜透性、酶活性及光合作用等產生影響，進而危害植物生長發育，而中藥材的有效成分絕大部分是次生代謝產物，因此中藥材育種、栽培等過程通過提高次生代謝產物含量，更易產生化感自毒作用[8-9]，研究結果表明三七、當歸、人參、黃芪、黃連等均存在化感自毒現象，嚴重制約了其可持續發展[10-13]。針對上述問題，中藥材連作障礙的表現性狀、內在機制及應對策略正成為該領域備受關注的重要方向[14-16]。

頭花蓼(PolygonumcapitatumBuch.-Ham. exD. Don)又名四季紅、石莽草等，為蓼科蓼屬多年生草本植物，是中國西南地區著名的“特色苗藥”，對治療泌尿系統疾病頗有療效，其中沒食子酸、黃酮類是其主要藥用成分[17-19]。頭花蓼種植面積隨著市場需求增加日趨擴大，其中貴州省目前種植面積達 1.33×103hm2以上。然而長期以來頭花蓼連作障礙問題突出，主要表現為出苗率低下、長勢較弱且不整齊、有效成分含量明顯降低等，嚴重影響其產量和藥用品質，成為制約該產業健康發展的瓶頸。目前關于頭花蓼連作障礙的報道集中在化學成分分析、連作后土壤養分變化分析以及不同施肥方式的調控措施，對水浸提物化感自毒的研究還不多見[20-21]。本研究通過人工制備頭花蓼根、莖、葉水浸提液，研究頭花蓼水浸提液對其種子發芽及幼苗生長的影響，為探明其連作障礙成因積累基礎數據，為提出治理對策提供依據。

1 材料與方法

1.1 頭花蓼根、莖、葉水浸提液制備

2016年3月于貴州省威門藥業頭花蓼種植基地采集生長旺盛的頭花蓼植株、種子。植株清洗晾干，分根、莖、葉剪碎研磨，分別準確稱量100 g于燒杯，加入100 ml無菌蒸餾水，室溫下浸提48 h，每12 h搖晃1次，抽濾獲得1 000 mg/ml原液，稀釋分別得到5 mg/ml、 10 mg/ml 、50 mg/ml 、100 mg/ml、250 mg/ml、500 mg/ml的根、莖、葉水浸提液，冷藏備用。

1.2 種子發芽試驗

取3 000粒頭花蓼種子置于燒杯，35 ℃溫水浸泡24 h，挑選籽粒飽滿的種子放于墊有2層濾紙的培養皿(均滅菌)，每皿40顆，滴加不同浸提液5 ml至濾紙濕潤飽和，3次重復。光照12 h/黑暗12 h條件于培養箱(22 ℃)培養，每2 d加蒸餾水后1 d加對應水浸提液補充皿內水分，以蒸餾水(0 mg/ml)為對照，連續培養15 d，每日記錄種子發芽情況，測量胚根(芽)長。

1.3 幼苗生長試驗

種子發芽試驗結束后，每皿選取發芽良好的種子，去掉皿蓋繼續培養幼苗10 d，操作方法同方法1.2，測量幼苗根長和芽長。

1.4 數據統計分析方法

發芽率=(發芽種子數/總供試種子數)×100%[13]；

發芽速率=[N1+(N2-N1)/2+…+(Nt-Nt-1)/t]×100%，其中Nt為t日內種子發芽率[22]；

發芽抑制率=(1-發芽種子數/對照組發芽種子數)×100%，負值表示有促進作用，正值表示有抑制作用[23]；

發芽勢=(發芽高峰期種子數/供試種子數)×100%，表征種子發芽快慢及活力強弱[13]；

發芽指數(GI)=∑[(Gt/Dt)]，Gt為第td萌發種子數，Dt為相應種子萌發天數[24]；

種子活力指數(VI)=∑[(Gt/Dt)]×Sx，其中，Sx為種苗平均總長度[25]；

化感指數(RI)=(1-C/T)×100%，其中，C為對照組各指標平均值，T為浸提液培養時各指標平均值。RI>0表示有促進作用，RI<0表示有抑制作用[12]；

綜合化感指數(M)：各處理的化感效應指數RI之和求平均值為M值，M>0表示有促進作用，M<0表示有抑制作用，絕對值大小表征作用強弱[26]。

2 結果與分析

2.1 頭花蓼種子發芽表觀特征

頭花蓼根、莖、葉水浸提液處理后其種子發芽數差異明顯，并出現種子胚根(芽)腐爛發霉、傾倒、葉片色澤暗淡等癥狀。其中，根水浸提液下種子胚芽均呈不同程度傾倒，當質量濃度為 250～500 mg/ml時，部分種子腐爛、發霉。莖水浸提液質量濃度≥100 mg/ml時，葉片色澤暗淡，部分胚芽傾倒，質量濃度至250 mg/ml時胚(根)芽腐爛逐漸明顯。葉水浸提液≥100 mg/ml時部分種子發霉、胚(根)芽腐爛逐漸明顯。3種不同水浸提液質量濃度均為5 mg/ml時其種子發芽數、日均發芽數分別高達 25.0～27.0顆、1.6～1.7顆，但水浸提液質量濃度升高至500 mg/ml時，種子發芽數、日均發芽數分別急劇降至 3.0～5.0顆、0.2～0.3顆。3種不同水浸提液下種子發芽后葉片數雖未變化，但其胚根和胚芽長度均受到明顯抑制，隨著濃度升高長度分別僅為對照組的 1/3～1/2和 1/3～3/4(表1)。

表1 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發芽表觀特征影響

同一列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 頭花蓼種子發芽率及發芽速率

頭花蓼根、莖、葉水浸提液下其種子發芽率分別介于 8.3%～66.7%、9.2%～63.3%、11.7%～66.7%(P<0.05)，3種不同水浸提液質量濃度為5 mg/ml時種子發芽率均達最高值，隨著質量濃度升高均逐漸降至約10%(圖1)。頭花蓼根水浸提液質量濃度為10 mg/ml時種子發芽速率達最高值0.2，葉水浸提液質量濃度為5 mg/ml時種子發芽速率達最高值0.1，莖水浸提液下種子發芽速率均低于對照組，隨著3種不同水浸提液質量濃度升高種子發芽速率均逐漸降至僅約為對照組的1/12(圖2)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖1 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發芽率的影響Fig.1 The effects of water extracts from different parts of P. capitatum on its seed germination rate

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發芽速率的影響Fig.2 The effects of water extracts from different parts of P. capitatum on its seed germination speed

2.3 頭花蓼種子發芽勢、發芽抑制率、發芽指數及活力指數

發芽勢表征種子發芽期間活力強弱，發芽勢越大，種子活力越強，發芽越整齊[16]。由表2可知，頭花蓼根水浸提液質量濃度10 mg/ml時種子發芽勢增大至22.5%，500 mg/ml時發芽勢驟減至0.8%，莖、葉水浸提液下隨著質量濃度升高種子發芽勢均逐漸降至0。當根、莖、葉水浸提液質量濃度5 mg/ml時，發芽抑制率均為負值，分別低至-11.2%、-7.7%、-13.1%，隨著質量濃度升高均為正值且不斷增大，500 mg/ml時分別高達86.2%、84.2%、80.4%。

種子發芽指數和活力指數用來綜合評估種子活力大小、發芽速度、發芽整齊度和幼苗健壯的潛勢[24-25]。由圖3、圖4可知，頭花蓼根、莖、葉水浸提液質量濃度不同時其種子發芽指數、活力指數變化規律相似，根水浸提液質量濃度為10 mg/ml時種子發芽指數及活力指數為最大值30.7、126.3，隨著質量濃度升高至500 mg/ml時分別降至1.9、5.0。莖、葉水浸提液質量濃度為5 mg/ml時種子發芽指數值分別高達23.1、23.0，活力指數值分別高達103.8、84.3，但隨著質量濃度升高均逐漸減小，至500 mg/ml時，莖水浸提液處理的發芽指數及活力指數分別低至0.5、1.1，葉水浸提液處理的發芽指數及活力指數分別低至1.8、3.1。

表2 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發芽勢、發芽抑制率影響

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖3 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發芽指數的影響Fig.3 The effects of water extracts from different parts of P. capitatum on its seed germination index

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖4 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子活力指數的影響Fig.4 The effects of water extracts from different parts of P. capitatum on its seed vigor index

2.4 頭花蓼種子發芽各指標化感指數(RI)及綜合化感指數(M)

由表3可知，當根水浸提液質量濃度低于50 mg/ml，莖、葉水浸提液質量濃度低于5 mg/ml時各指標RI值總體為正，表明對種子發芽率、發芽速率和發芽指數均具有促進作用，其他質量濃度時均為負值且隨著濃度升高至250 mg/ml時對種子發芽速率、發芽指數抑制作用最強，500 mg/ml處對種子發芽率抑制作用最強。觀察綜合化感指數M值，除500 mg/ml時根水浸提液對種子發芽抑制最明顯外，其余質量濃度時莖、葉水浸提液抑制作用顯著強于根水浸提液。

2.5 頭花蓼不同部位水浸提液對其幼苗生長的影響

頭花蓼幼苗培養中出現不同程度幼苗變纖細、傾倒，根、芽發霉腐爛，葉片色澤暗淡等癥狀。其中，根水浸提液下幼苗較空白更纖細，質量濃度至250 mg/ml時幼苗出現傾倒、發霉和腐爛等現象。莖、葉水浸提液質量濃度≥100 mg/ml時，幼苗葉片色澤暗淡，部分幼苗傾倒，幼苗根芽腐爛逐漸明顯。由表4可知，頭花蓼根水浸提液低于100 mg/ml、莖水浸提液低于50 mg/ml、葉水浸提液低于10 mg/ml時對幼苗根長影響均較小，而隨著質量濃度升高產生抑制作用， 500 mg/ml時幼苗根長分別減至對照的2/3、2/3、1/3。根、葉水浸提液對幼苗芽長均具有抑制作用，500 mg/ml時幼苗芽長分別為2.3 cm、1.9 cm，莖水浸提液為10mg/ml時幼苗芽長達最高值3.4 cm，濃度進一步升高時對幼苗芽長無顯著影響但芽長均值降低至2.2 cm，幼苗芽長整齊度下降。由表5可知，頭花蓼根水浸提液為5mg/ml 時幼苗根芽比高達0.8，顯著高于對照組，500 mg/ml時胚根芽比僅為0.3，顯著低于對照組，其他質量濃度均無顯著差異。莖水浸提液對種子及幼苗(胚)根芽比無顯著影響。葉水浸提液為5 mg/ml時胚根芽比高達1.0，顯著高于對照組，500 mg/ml時幼苗胚根芽比僅為0.4，顯著低于對照組。

表3 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發芽化感指數(RI)的影響

表4 頭花蓼不同部位水浸提液對其幼苗生長的影響

同一列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

表5 頭花蓼不同部位水浸提液對其種子發芽及幼苗生長的影響

同一列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

中藥材化感自毒現象較為普遍[27-29]。中藥材栽培中不僅要求高產量，同時更注重品質，因此提高中藥材次生代謝產物(往往是藥用成分)含量是其栽培的目標。這些次生代謝產物往往屬于易揮發性或水溶性的酚類、萜類等物質，通過自身揮發和雨水淋溶等途徑向根際環境釋放[30]。栽培中選擇不斷提高中藥材次生代謝產物含量，在逆境下更易向根際環境釋放和積累次生代謝產物，進而轉為影響中藥材栽培的化感物質，如造成中藥材根際環境病蟲害逐年增加，根際土壤生態結構逐漸改變，破壞中藥材細胞膜結構和抑制酶活性等，這是中藥材相比其他作物更易產生化感自毒作用而導致連作障礙的主要原因[31]。同時，中藥材化感物質成分復雜且多種化感物質共同作用往往表現為低濃度時促進中藥材生理代謝，很可能成為誘導種子發芽和促進幼苗生長的活性物質，但高濃度時產生抑制作用，這與高濃度化感物質造成中藥材栽培環境脅迫，反過來環境脅迫時又促使中藥材釋放和積累更多化感物質，加劇了中藥材化感自毒作用的產生有關[32]。

本研究中頭花蓼根、莖、葉水浸提液對其種子發芽或幼苗生長影響具有一定“低促高抑”特征，但抑制影響更為明顯。3種不同水浸提液濃度高于10 mg/ml時逐漸出現種子及幼苗發霉腐爛、葉片色澤暗淡、幼苗變纖細(或傾倒)以及出苗不整齊等自毒癥狀，500 mg/ml時，種子發芽率降至10%左右，發芽速率僅為對照組的1/12，發芽抑制率達80.4%以上，發芽勢降至0.8%以下，發芽指數和活力指數僅為0.5、1.1。各指標化感指數及綜合指數均表明頭花蓼不同部位水浸提液對種子發芽或幼苗生長抑制作用總體表現為莖水浸提液>葉水浸提液>根水浸提液。綜上，頭花蓼根、莖、葉不同部位水浸提液具有明顯的化感自毒作用，很可能是其連作障礙的重要因素，但水浸提液化學成分中起主導作用的關鍵物質有待進一步研究。針對實際生產中頭花蓼連作栽培時在“環境脅迫”下逐年累積化感物質，連作障礙現象明顯，建議采取以下措施：(1)盡可能清理出收獲后土壤中頭花蓼植株、根等殘留物，避免中藥材自身各類化感物質產生；(2)采用深耕翻土與烈日暴曬等相結合，可有效殺死有害微生物和減少化感物質累積；(3)建立科學的多群體輪作、間作或套作制度進行生態調節，這也是生產實踐中減緩作物連作障礙影響的有效方式。

致謝： 特別感謝貴州威門藥業股份有限公司為本研究開展提供便利!

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