草魚MyoD基因SNP和Indel標記的篩選及其與生長性狀的關聯分析

陳 靜， 何吉祥， 樊佳佳， 黃 龍， 吳本麗， 宋光同， 汪 翔， 武 松

(1.安徽省農業科學院水產研究所，安徽 合肥 230031； 2.農業部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室，廣東 廣州 510380)

生肌決定因子基因MyoD是生肌調節因子基因MRFs家族(MyoD、MyoG、Myf5和MRF4)的主要成員之一，生肌調節因子具有一個保守的堿性螺旋-環-螺旋結構(bHLH)[1-2]。MyoD在成肌細胞分化為肌纖維的過程中起關鍵的正向調控作用，控制著很多關鍵基因的表達[3-5]。因為時空表達模式不同，4個MRFs家族成員在動物肌肉發育過程中所發揮的作用不同[6]，其中MyoD基因是脊椎動物胚胎期肌肉發育的主要調控基因，主要作用是促進骨骼肌的形成和分化，缺少MyoD基因可導致成肌細胞無法正常增殖和分化[7-8]。MyoD與肌肉基因啟動子的E-BOX區域結合后，能激活肌肉特異性轉錄，進而促進肌前體細胞的增殖和分化，另外MyoD基因還可使成纖維細胞及脂肪細胞等轉化為成肌細胞，最終分化為成熟肌纖維[9]。

單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism, SNP)和插入/缺失(Insertion/deletion, Indel)標記作為新型分子標記，廣泛分布于整個基因組，是動植物中普遍存在的一種遺傳標記[10-12]。草魚(Ctenopharyngodonidella)是中國淡水養殖魚類中產量最大的養殖品種，至今仍沒有通過國家良種審定委員會鑒定的人工選育的良種。基于MyoD基因對動物肌肉發育和生長的重要作用，本研究以MyoD基因作為草魚生長性狀的候選基因，通過直接測序法檢測SNP和Indel標記，并與相關生長性狀進行關聯分析，以期獲得與草魚生長性狀相關聯的SNP和Indel標記作為草魚分子標記輔助選育的候選標記，縮短育種周期，提高選擇效率。

1 材料與方法

1.1 材料

收集盡量多來源的草魚共20尾作為篩選突變位點的樣本，取魚的尾鰭，-20 ℃保存備用。生長性狀關聯性分析的草魚樣品采自長豐縣盛源養殖合作社，隨機選擇同期繁殖、同塘養殖的3齡草魚共297尾，測量體質量、全長、體長、體寬、體高、眼間距、尾柄長和尾柄高8項生長指標，同時剪取尾鰭-20 ℃保存。

1.2 基因組DNA的提取與檢測

使用QIAamp DNA Mini Kit (北京Qiagen公司產品)提取基因組DNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的質量，-20 ℃保存待用。

1.3 MyoD基因的PCR擴增及突變位點基因分型

根據本實驗室克隆得到的草魚MyoD基因序列(GenBank登錄號：MG544985)與草魚全基因組測序序列(http://www.ncgr.ac.cn/grasscarp/)[13]進行比較，在5′側翼區、外顯子和內含子上篩選多態位點。根據突變位點采用Primer Premier 5.0 軟件進行引物設計。

以不同來源的20尾草魚為模板進行PCR擴增。PCR反應體系包括10.0 μl 2×TaqPCR master mix、上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μl、模板DNA 20 ng，加ddH2O至20.0 μl。PCR反應程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共35個循環，72 ℃延伸10 min，保存于4 ℃。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物純化后送至上海捷瑞生物工程有限公司測序。測序結果用軟件BioEdit進行比對和篩選，獲得多態性高、分型穩定的突變位點。采用直接測序法對297尾草魚MyoD基因的突變位點進行分型。

1.4 數據統計分析

采用PopGen 32軟件計算有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)，利用Picalc程序包計算各位點的多態信息含量(PIC)。采用SPSS 20軟件一般線性模型(General linear model，GLM)分析突變位點各基因型與生長性狀的關聯程度，因變量為草魚8項生長指標，自變量為篩選到的突變位點的不同基因型。其生物統計模型為：Yij=μ+Bi+eij，其中Yij表示某性狀第i個標記在第j個個體上的觀測值，μ表示試驗觀測的所有個體平均值，Bi表示第i個標記的效應值，eij表示對應個體觀測值的隨機殘差效應。

2 結果與分析

2.1 MyoD基因突變位點篩選

通過序列比對，在MyoD基因5′側翼區、外顯子和內含子上共篩選得到6個突變位點，分別命名為M1(940后T堿基的插入)、M2(A1601G)、M3(1630后重復單元AATAGCCT的缺失)、M4(G1669A)、M5(A1681T)、M6(T2322G)。其中M1位于5′側翼區，M2、M3、M4和M5位于內含子1，M6位于外顯子3。M6位點(T2322G)的突變沒有導致氨基酸的變化，屬于同義改變。

共設計3對引物在20個草魚樣本中對這6個突變位點進行驗證(引物序列和參數見表1)，3對引物PCR 擴增分別獲得409 bp、354 bp和245 bp片段。PCR產物經測序和比對后獲得多態性高、分型穩定的4個位點，即M1、M3、M4和M5。

表1 草魚MyoD基因擴增多態位點檢測引物

2.2 MyoD基因突變位點在草魚群體中的遺傳結構分析

采用直接測序法對297尾草魚MyoD基因的4個多態位點進行基因分型，統計4個突變位點的遺傳參數。結果(表2)表明，有效等位基因數(Ne)為 1.422 0～1.978 6，觀測雜合度(Ho)為 0.268 5～0.466 4， 期望雜合度(He)為 0.297 2～0.495 4，多態信息含量(PIC)為 0.252 7～0.372 3，He和PIC均大于0.25小于0.50，說明4個突變位點具有中度多態性[14]。經χ2檢驗，Hardy-Weinberg平衡常數分別為0.690 3、0.175 6、0.093 2、0.311 8，表明試驗群體在該4個突變位點均處于哈溫平衡狀態(P>0.05)。

表2 草魚MyoD基因SNP和Indel遺傳多樣性參數

2.3 MyoD基因突變位點與草魚生長性狀的關聯分析

采用一般線性模型分析草魚MyoD基因4個多態位點不同基因型與生長性狀的相關性(表3)。M1位點不同基因型個體間的體長、全長、尾柄長和尾柄高存在顯著差異(P<0.05)，純合缺失基因型(DD)顯著大于純合插入基因型(TT)，為優勢基因型；M3和M4位點不同基因型個體間的生長性狀差異均不顯著(P>0.05)；M5位點不同基因型個體間的體質量、體寬、體高和眼間距存在顯著差異(P<0.05)，優勢基因型為TT。

3 討 論

本研究中，在草魚MyoD基因中共發現4個多態性高、分型穩定的突變位點，即M1、M3、M4和M5，其中M1位于5′側翼區，M3、M4和M5位于內含子1。位于5′側翼區的M1位點雖然不編碼氨基酸，但由于5′UTR在基因表達調控中有重要作用，因而其序列突變可能會對基因表達調控產生變化進而影響機體的多種性狀[15-16]，在本研究中就發現該突變與草魚全長、體長等生長性狀有顯著相關。有研究結果表明，基因組中的突變位點絕大多數位于內含子區域，而外顯子相對較保守[8,17]。本研究在草魚MyoD基因中發現的4個突變位點中就有3個位于內含子，可能是因為內含子不參與氨基酸編碼，與外顯子相比其受到的選擇壓力較小，變異更容易積累[18-19]。

表3 草魚MyoD基因SNP和Indel位點基因型與生長性狀的相關性

相同位點同列數值后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

MyoD基因是生肌調節因子基因MRFs家族的主要成員之一，是脊椎動物胚胎期肌肉發育的主導調控基因之一，對骨骼肌的形成和分化起主要作用，因此，MyoD基因的核苷酸變異可能會影響一些與肌肉肉質和生長性能相關的生產性狀[20]。MyoD基因多態性與生產性能的關聯研究在畜牧領域中已經有較多報道。Han等[21]研究發現大白豬MyoD基因的SNP位點g.257A>C與肌肉pH值呈顯著關聯性。田璐等[22]在肉牛上發現MyoD基因內含子2中不同基因型對肉牛的宰前活質量、胴體質量、凈肉質量、高檔肉質量、眼肌面積等性狀影響極顯著或顯著。褚敏等[20]在大通耗牛MyoD1基因3′UTR的1 976 bp處發現1個突變位點，對體質量、胸圍、體斜長方面影響顯著。李萬貴等[23]在櫻桃谷鴨MyoD基因外顯子4發現2個SNP位點，突變基因型TT鴨群體顯著小于野生基因型AA群體。Chen等[24]研究發現MyoD1a和MyoD1b對虹鱒肉質有重要影響。陳松波等[25]研究發現牙鲆MyoD基因內含子1上的SNPs對牙鲆的生長性狀影響顯著。在本研究中，MyoD基因多態性位點與草魚生長性狀的相關分析結果表明，5′側翼區M1位點不同基因型個體間的體長、全長、尾柄長和尾柄高存在顯著差異(P<0.05)，純合缺失基因型(DD)顯著大于純合插入基因型(TT)；內含子1中M5位點不同基因型個體間的體質量、體寬、體高和眼間距存在顯著差異(P<0.05)，與這些經濟性狀連鎖的優勢基因型為TT。因此可以將草魚MyoD基因作為分子輔助草魚選育的候選基因，位點M1(940后T堿基的插入)和M5(A1681T)作為草魚分子標記輔助育種的候選分子標記。

參考文獻：

[1] BUCKINGHAM M. Making muscle in mammals[J]. Trends Genet, 1992, 8(4):144-149.

[2] 蔣運良,李 寧,吳常信.肌肉生成的分子生物學研究進展(綜述)[J]. 農業生物技術學報, 1999, 7(2):201-204.

[3] FRANCETIC T, LI Q. Skeletalmyogenesis andMyf5 activation[J]. Transcription, 2011, 2(3): 109-114.

[4] RESCAN P Y. Regulation and functions of myogenic regulatory factors in lower vertebrates[J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2001, 130(1):1-12.

[5] NAIDU P S, LUDOLPH D C, TO R Q, et al. Myogenin and MEF2 function synergistically to activate the MRF4 promoter during myogenesis[J]. Molecular and Cellular Biology, 1995, 15(5): 2707-2718.

[6] CARVAJAL J J, RIGBY P W. Regulation of gene expression in vertebrate skeletal muscle[J]. Experimental Cell Research, 2010, 316(18):3014-3018.

[7] WYZYKOWSKI J C, WINATA T I, MITIN N, et al. Identification of novelMyoDgene targets in proliferating myogenic stem cells[J]. Molecular & Cellular Biology, 2002, 22(17): 6199-6208.

[8] 于凌云,白俊杰,葉 星,等. 大口黑鱸MyoD基因結構和單核苷酸多態性位點的篩選[J]. 水產學報, 2009, 33(1):1-8.

[9] 李永平,梁炳生.MyoD肌形成作用機制研究進展[J]. 國際骨科學雜志, 2007, 28(1):37-40.

[10] 趙廣珍,賈 青,張翠翠,等. 豬MyoD1基因多態性與肉質性狀的相關分析[J]．河北農業大學學報, 2012, 35(4):90-94.

[11] 程金花,趙文明,包文斌,等. 皖西白鵝Pit-1基因插入/缺失多態性及其對早期體重的影響[J]. 農業生物技術學報, 2008, 16(3):426-429.

[12] 邱峰芳,聶慶華,金衛根,等. 雞PIT-1基因57bp插入/缺失多態與生長和屠體性狀的相關研究[J]. 江西農業大學學報, 2006, 28(2):284-288.

[13] WANG Y P, LU Y, ZHANG Y, et al. The draft genome of the grass carp (Ctenopharyngodonidellus) provides insights into its evolution and vegetarian adaptation[J]. Nature Genetics, 2015, 47(6):1-8.

[14] BOSTEIN D, WLLITE R L, SKOLNICK M, et al . Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism [J]. The American Journal of Human Genetics, 1980, 32:314-331.

[15] WANG L, LI K, XU Q, et al. Potential synergy between SNP and CpG-A or IL-1 beta in regulating transcriptional activity of IL-20 promoter[J]. The Journal of Investigative Dermatology, 2014, 134(2): 389-395.

[16] YANG Z H, ZHOU C L, ZHU H, et al. A functional SNP in the MDM2 promoter mediates E2F1 affinity to modulate cyclin D1 expression in tumor cell proliferation[J]. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 2014,15(8):3817-3823.

[17] NIE Q, LEI M, QU Y, et al. Identification and characterization of single nucleotide polymorphisms in 12 chicken growth-correlated genes by denaturing high performance liquid chromatography [J]. Genetics Selection Evolution, 2005, 37 (3): 339-360.

[18] 張 猛,陳 勇,沈玉幫,等. 草魚MSTN-1基因多態性及與早期生長性狀和肌肉成分關聯分析[J]. 水產學報, 2016, 40(4):618-625.

[19] ZHAO Z M, FU Y X, HEWETT E D, et al. Investigating single nucleotide polymorphism (SNP) density in the human genome and its implications for molecular evolution [J]. Gene, 2003, 312:207-213.

[20] 褚 敏,閻 萍,粱春年,等. 大通牦牛MyoD1基因3′UTR SNPs多態性及其與生長性狀相關性的研究[J]. 中國畜牧獸醫, 2012, 39(2):111-113.

[21] HAN X, JIANG T, YANG H, et al. Investigation of four porcine candidate genes (H-FABP,MYOD1, UCP3 and MASTR) for meat quality traits in large white pigs[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(6): 6599-6605.

[22] 田 璐,許尚忠,岳文斌,等.MyoD基因對肉牛胴體性狀影響的分析[J]. 遺傳, 2007, 29(3): 313-318.

[23] 李萬貴,張依裕,王單單,等. 櫻桃谷鴨MyoD1基因外顯子4多態與體尺的關聯效應研究[J]. 基因組學與應用生物學, 2015, 34(5):950-954.

[24] CHEN W X, MA Y, LIU K H. Association ofMYOD1aandMYOD1bgene polymorphisms and meat quality traits in rainbow trout[J]. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(3): 9034-9044.

[25] 陳松波,龔 麗,范兆廷,等. 牙鲆MyoD基因單核苷酸多態性位點的篩選[J]. 水生生物學報, 2013, 37(5):863-868.