蘋果中福美胂殘留的RP-HPLC檢測

牛鵬飛， 申 遠， 李 帥, 郭玉蓉

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院， 陜西 西安 710062)

福美胂是一種二硫代氨基甲酸酯類殺菌劑，化學名稱為三-N-二甲基二硫代氨基甲酸胂。其抗菌性強并且具有持效期長,在樹皮死組織部位滲透力強的特點，對多種農作物的多種病害均有防治效果，尤其對蘋果腐爛病有較好的防治作用[1-2]，因此曾有過比較廣泛的使用，尤其是在北方果樹生產上有廣泛應用[2]。福美胂為中等毒性，可通過呼吸道、胃腸道和皮膚吸收，排泄出體外的過程長，還會在體內轉化成毒性可能更大的無機三價砷及其衍生物，產生無機砷中毒癥狀，對皮膚、粘膜亦有刺激作用，一旦發生福美胂中毒，其診斷、治療均較困難[3]。由于在果園中使用福美胂，造成果樹、環境甚至生態系統嚴重污染[4-5]，因此早在2007年以前，中國就已禁止砷制劑在果樹生產中的使用[6]。但在2012年，有媒體報道，在中國某蘋果主產區，一種無任何標志、小作坊式生產的藥袋被部分果農使用，這種藥袋內部涂布福美胂和退菌特，并包裹在幼果上直至其成熟,而對于蘋果中是否確實存在福美胂和退菌特，國內多家檢測機構都表示無法檢測。中國作為世界上最大的水果、蔬菜生產國和主要的出口國[7],中國蘋果的出口對全球蘋果市場影響巨大[8]，“藥袋”事件對中國蘋果產業產生的國際負面影響不容忽視。福美胂作為“藥袋事件”的元兇之一，理應受到嚴格的監管。但目前國際上福美胂的藥物殘留檢測尚屬空白，因此福美胂殘留檢測方法的建立，尤其是確定蘋果中福美胂殘留的檢測方法成為保證蘋果產業安全的首要任務。國際上，二硫代氨基甲酸酯類農藥的檢測方法有GC法[9]、GC-MS法[10]、HPLC-MS法[11-13]、酶聯免疫吸附劑測定法[14]以及衍生化結合HPLC法[15]，但上述方法均未涉及福美胂的檢測。在國內，二硫代氨基甲酸酯類農藥的檢測多采用測定CS2含量的間接方法，即檢測二硫代氨基甲酸根酸性水解釋放出的CS2量[16]。但因二硫代氨基甲酸酯類農藥種類很多，酸性水解都會產生CS2，檢測時無法區分CS2來源，因此無法定量檢測福美胂[17]。而檢測食品中總砷[18-19]、無機砷[18-21]和有機砷[22]的方法也都無法準確定量福美胂的殘留量。目前，福美胂殘留的定量檢測仍是一個空白，國內外均無此類報道。本研究以此為切入點，擬建立蘋果中福美胂殘留的快速檢測方法，解決蘋果中福美胂無法定量檢測的難題，以保障中國蘋果產業健康發展。

1 材料與方法

1.1 材料

市售無公害鮮蘋果

1.2 試劑

福美胂標準品(純度≥99.0%)購自河北冠龍農化有限公司,乙腈(色譜純)購自美國Fisher公司,三氟乙酸(分析純)購自上海科豐化學試劑有限公司,苯(分析純)購自天津天力化學試劑有限公司,試驗用水為超純水。

1.3 標準品儲備液制備

準確稱取福美胂標準品53.1 mg，乙腈溶解、定容至100 ml容量瓶,制成濃度為531 mg/L的福美胂標準儲備液,置于冰箱中4 ℃備用。

1.4 儀器

高效液相色譜系統：P680型泵(在線脫氣機，梯度混合器及20 μl定量環)和UVD 170U型紫外檢測器，美國DIONEX公司產品；DiamonsilTM型二代C18色譜分析柱(250.0 mm×4.6 mm ID，5.0 μm),DIKMA有限公司產品；AT-330型柱溫箱,天津奧特賽恩斯儀器有限公司產品；U-3010型紫外/可見分光光度計,日本HITACHI公司產品；DN-12A氮氣吹干儀,天津市東康科技有限公司產品；FW400A高速萬能粉碎機,北京科偉永興儀器有限公司產品；SHZ-III型循環水真空泵,上海亞榮生化儀器廠產品；AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產品。

1.5 色譜條件

流速：1.0 ml/min，進樣體積：20 μl，檢測波長：247 nm,柱溫：30 ℃,流動相：以0.1%三氟乙酸水溶液為溶劑配制乙腈含量為10%溶液作為A相，100%乙腈為B相(A相∶B相=60∶40，體積比)。

1.6 樣品的前處理

蘋果去梗，保留整果，高速粉碎成果泥狀。準確稱取10.0 g蘋果泥置于100 ml磨口三角燒瓶中，加入20 ml苯，劇烈震蕩提取30 min，靜止5 min，取上清萃取液，重復萃取4次，合并萃取上清液于100 ml容量瓶中，用乙腈定容,充分搖勻，取10 ml萃取液，氮氣吹干，用2 ml乙腈復溶，過0.45μm有機濾膜，待分析。

1.7 標準溶液的色譜分離及檢測系統穩定性的考察

采用方法1.5的色譜條件，對福美胂標準溶液進行分離和檢測，同時對適當濃度的標準溶液連續進樣3次，以峰系數(保留時間、峰值和峰面積)變異系數(CV)考察HPLC系統以及分析方法運行的日內穩定性。同時對保留時間的日間精密度(1 d進樣2次，共進樣3 d)進行分析，以CV評價色譜系統以及方法的日間穩定性。

1.8 標準曲線的建立

分別取福美胂標準品儲備液1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml于6只100 ml容量瓶中，乙腈定容，過0.45 μm微孔有機濾膜，按方法1.5的色譜條件進行測定，以峰面積對濃度進行線性回歸。

1.9 檢出限、定量限的測定

在同一批樣品中添加不同濃度的福美胂標準品溶液，對樣品進行處理，按方法1.5的色譜條件進行檢測。

1.10 加標回收率的測定

在同一蘋果樣品中添加不同體積的福美胂標準品溶液，按方法1.6的方法進行處理，按方法1.5的色譜條件進行檢測(重復5次)，以評價樣品前處理對福美胂回收率的影響。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

以乙腈為空白溶液，對濃度為5.31 mg/L福美胂標準品儲備溶液進行紫外全波長掃描(圖1)，試驗結果表明，福美胂的最大吸光度在247 nm處。

圖1 福美胂標準溶液的紫外掃描光譜圖Fig.1 Ultraviolet scanning spectra of standard solution of asomate

2.2 福美胂的分離

在相同的色譜條件下，對同一濃度的福美胂標準品溶液連續進樣3次，記錄保留時間、峰值以及峰面積值。如表1所示，福美胂保留時間、峰值以及峰面積的CV(n=3)均小于2%，其中保留時間的日精密度CV(n=3)為0.16%。由此可見，儀器和方法的穩定性均比較好。

表1 福美胂檢測系統的穩定性

連續進樣6次(1 d 2次，共3 d)，考察福美胂保留時間、峰值以及峰面積的日間精密度。如表2所示，福美胂保留時間、峰值和峰面積的日間精密度CV均小于1%，表明儀器和方法的日間精密度可以滿足檢測要求。

表2 福美胂檢測方法的日間精密度

2.3 福美胂標準曲線

如圖2所示，福美胂濃度與峰面積呈現良好的線性關系，Y=0.378 0x-0.123 2，R2=0.999 7，線性范圍：5.31 mg/L至53.1 mg/L。其中，Y為福美胂的峰面積(mAU·min)；x為福美胂質量濃度(mg/L)。因此，用峰面積定量法對福美胂進行定量分析是可行的。

圖2 福美胂標準曲線Fig.2 The standard curve of asomate

2.4 福美胂檢測限

以S/N=3定為檢出限(LOD)，以S/N=10定為定量限(LOQ)，測定蘋果中福美胂的LOD為0.295 3 mg/kg，LOQ為1.206 7 mg/kg。

2.5 福美胂加標回收率

按方法1.10的方法，在蘋果樣品中加入適當體積的福美胂標準品溶液后進行色譜分析。如圖3、圖4和圖5所示，福美胂得到了良好的分離與檢測。

圖3 福美胂標準溶液的色譜圖Fig.3 The chromatogram of standard solution of asomate

圖4 蘋果空白樣品色譜圖Fig.4 The chromatogram of blank apple sample

圖5 添加福美胂的蘋果樣品色譜圖Fig.5 The chromatogram of apple sample with asomate

參考福美雙和福美鋅在水果中的殘留限量[12]，在蘋果樣品中添加不同劑量的福美胂標準品，進行色譜分析，計算其加標回收率。如表3所示，福美胂的加標回收率為 76.56%～100.22%，變異系數(CV)為 4.86%～7.51%。因此，該色譜分析方法對于蘋果中福美胂殘留的分析是準確、可靠的。

3 結 論

本研究建立了定量檢測蘋果中福美胂殘留的RP-HPLC方法。該方法在準確度、精密度以及回收率等方面均能滿足國家對農藥殘留分析質量控制要求[23],可以用于蘋果中福美胂殘留檢測。

表3 蘋果樣品中福美胂加標回收率(n=5)

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