豬糞中溫和高溫厭氧發酵沼液對微藻培養的影響

王麗麗 司愛龍 李 澤 WANG Zhiwu 隋 超 王忠江

(1.東北農業大學工程學院， 哈爾濱 150030； 2.弗吉尼亞理工學院暨州立大學土木環境工程系， 黑堡 VA 24061)

0 引言

微藻生物質與其他陸生生物質資源相比，具有光合作用效率高、生長速度快、不占耕地、產品附加值高等優點[1-2]，近年來得到廣泛關注。但微藻培養過程需要向培養液中添加大量的N、P等營養元素[3-4]，極大地增加了微藻培養的成本[5]，制約了微藻培養產業的發展。近年來大中型沼氣工程在我國得到了迅速推廣，這些沼氣工程基本采用濕式厭氧發酵工藝，在產生新能源沼氣的同時也產生了大量的沼液廢水[6-8]，而這些沼液富含濃度較高的有機物和N、P等營養成分以及種類繁多的微生物等[9-11]，處置不當將會對環境造成威脅[12-13]，因此沼液利用途徑及利用量的拓展引起研究者的關注。如將沼氣厭氧發酵后富含N、P等營養成分的沼液作為微藻培養的營養液，在一定程度上可以解決沼液的處置問題[14-17]，還可以降低微藻培養過程中補充氮源和磷源的成本[18-19]。

微藻在培養過程中容易受到雜菌污染[20]。沼氣發酵的原料種類眾多，不同發酵原料沼氣發酵后的沼液成分差別較大，如畜禽的食物及消化道內存在的大量病原微生物在畜禽糞便中大量殘留，此外由于目前規模化養殖場中各種化學添加劑的濫用，也使相對較多的重金屬殘留在畜禽糞便中，以這些畜禽廢棄物為原料進行沼氣發酵產生的沼液中存在大量的病原微生物等雜菌及重金屬[6]，容易對微藻產生污染，所以在前期研究中很多學者[21-22]均將沼液滅菌后再進行微藻的培養試驗，進而增大了微藻培養成本，影響微藻產業的后續應用和推廣。

此外，目前大規模工業化生產的沼氣工程普遍采用的是35℃的中溫厭氧發酵和55℃的高溫厭氧發酵工藝。與35℃的中溫厭氧發酵工藝相比，55℃的高溫厭氧發酵工藝不但對沼氣發酵過程影響顯著，而且由于高溫厭氧發酵的滅菌效果更為明顯，對厭氧發酵后的沼液特性也有顯著影響，經55℃高溫厭氧發酵后獲得的沼液中各種病原菌的數量明顯低于35℃中溫厭氧發酵[23-24]。所以，中溫厭氧發酵和高溫厭氧發酵后沼液作為微藻培養的營養源，會對后續的微藻生長產生影響。而目前利用高溫發酵沼液進行微藻培養方面的研究鮮見報道，關于中溫發酵沼液和高溫發酵沼液用于微藻培養的系統性對比研究未見報道。

本文針對以上問題，以豬糞中溫35℃和高溫55℃厭氧發酵后的沼液為原料，在滅菌和不滅菌的條件下，系統研究不同沼液對微藻培養過程各主要指標的影響規律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1沼液及預處理

試驗采用的沼液取自東北農業大學生物質能源實驗室，沼氣發酵的原料為豬糞，發酵時間為30 d，35℃中溫厭氧發酵后未固液分離沼液的初始化學需氧量(COD值)為4 861.28 mg/L，pH值為7.88，總氮質量濃度為2 652.53 mg/L，總磷質量濃度為52.61 mg/L，氨氮質量濃度為2 229.19 mg/L，Cu2+質量濃度為0.79 mg/L，Fe2+質量濃度為1.42 mg/L，Zn2+質量濃度為0.40 mg/L，濁度為1 024 NTU；55℃高溫厭氧發酵后未固液分離沼液的初始化學需氧量(COD值)為5 029.95 mg/L，pH值為7.86，總氮質量濃度為2 833.73 mg/L，總磷質量濃度為49.25 mg/L，氨氮質量濃度為2 328.76 mg/L，Cu2+質量濃度為0.77 mg/L，Fe2+質量濃度為1.38 mg/L，Zn2+質量濃度為0.39 mg/L，濁度為978 NTU。沼氣發酵后的剩余物經孔徑0.075 mm尼龍標準篩去除大顆粒物，之后利用3-30K型高速離心機(德國Sigma公司)在10 000 r/min的條件下去除小顆粒物獲得本試驗所用沼液，之后儲存于4℃冰箱內備用，試驗前經不同處理的離心后沼液的相關指標如表1所示。

表1 沼液特性Tab.1 Characteristics of biogas slurry

1.1.2藻種

試驗所用的藻種為蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)與普通小球藻(Chlorellavulgaris)，均由中國科學院水生生物研究所提供，藻種編號為FACHB-5(5號藻種)和FACHB-8(8號藻種)。

1.2 試驗方法及條件

藻種采用沼液和BG11培養基的混合液進行培養，BG11培養基的配方見文獻[25]，豬糞沼液的添加量均為20%，試驗采用的藥品均為分析純。利用OBY-Q600-SEI型人工氣候培養箱(常州歐邦電子有限公司)進行微藻培養，培養溫度為(26±1)℃，光照強度為4 000 lx，24 h連續光照，同時利用HG-180型旋渦式氣泵(臺灣亞士霸電機集團有限公司)向微藻培養液通入空氣，通氣量1.5 L/min，空氣在進入培養液前經0.2 μm濾膜過濾。

試驗容器為1 000 mL三角瓶，內裝600 mL培養液，在未調節pH值條件下將對數期藻種各100 mL分別加入各組培養液中，每組2個重復，進行批式培養，培養周期為11 d，每天取樣測680 nm處OD值(光密度)、pH值，每隔1 d取樣，利用3-30K型高速離心機在10 000 r/min的條件下離心，之后測定上清液中氨氮質量濃度、總氮質量濃度、總磷質量濃度和COD值。

1.3 分析方法

生物量測定采用光密度法[26]。取小球藻藻液，用紫外可見分光光度計測定其在680 nm吸收波長下的OD值，以此衡量小球藻在培養過程中的相對生長量。原料沼液的濁度采用分光光度法測定680 nm下的吸光度[27-28]，培養液的COD值測定采用重鉻酸鹽法，參照 GB 11914—1989《水質化學需氧量的測定重鉻酸鹽法》；總氮和氨氮采用凱氏定氮法測定[29]，所用儀器為Kjeltec 2300型全自動凱氏定氮儀(丹麥FOSS公司 )，總磷測定采用鉬酸銨分光光度法，參照GB 11893—1989《水質總磷的測定 鉬酸銨分光光度法》[30]。采用OriginPro 9.32進行數據處理，采用SPSS 22.0進行差異顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 微藻生長

不同沼液對微藻生長的影響如圖1所示。

圖1 微藻生長曲線Fig.1 Growth curves of microalgae

從圖中可以看出，各試驗組的整體變化規律基本一致，即在試驗開始后前3 d的680 nm處OD值緩慢上升，從第4天開始各試驗組的OD值開始快速上升，在第10天達到各自的較高值，之后逐漸趨于穩定。在本試驗條件下，各試驗組的微藻生長趨勢符合生物學中的S型生長曲線，利用OriginPro軟件擬合微藻生長曲線，經過不同S型函數的擬合結果，最終選擇擬合度較高的DoseResp函數，各試驗組擬合后的方程如表2所示，方程對各條曲線的擬合度均不低于0.984 6。從圖中還可以看出，5號藻種和8號藻種在滅菌和未滅菌沼液中均能較好地生長，各試驗組經短暫適應期后微藻的生長速率均出現較大的增加，各試驗組的OD值均由試驗開始時的0.40～0.48升高到1.93～2.57。此外滅菌試驗組和未滅菌試驗組在前期對沼液的適應性方面未表現出明顯的優勢，適應時間均為3 d，但滅菌各試驗組680 nm處OD值均高于各自對應的未滅菌試驗組，經顯著性分析后差異達到極顯著水平(P<0.01)，這說明滅菌試驗組的微藻生長速率高于未滅菌試驗組，但高溫滅菌也將增加微藻的培養成本，不利于后續微藻的規模化培養。從圖中還可以看出，在滅菌和未滅菌試驗組中55℃厭氧發酵后沼液各試驗組的整體表現均優于各自對應的35℃厭氧發酵后沼液試驗組，經顯著性分析后差異達到極顯

表2 微藻生長曲線擬合方程Tab.2 Fitting equations of microalgae growth curves

著水平(P<0.01)，這與許智等[23]的研究相對應，許智等通過研究發現在55℃厭氧發酵條件下經96 h對大腸桿菌的殺滅百分比達99%，而35℃厭氧發酵條件對大腸桿菌基本沒有殺滅作用，而本研究采用的是在55℃和35℃條件下經30 d厭氧發酵后獲得的沼液，55℃厭氧發酵后沼液中大腸桿菌等雜菌的數量少于35℃厭氧發酵后沼液，對后續微藻培養過程的抑制作用更小，此外滅菌后的55℃高溫厭氧發酵后沼液的氨氮和總氮質量濃度均略高于滅菌后的35℃高溫厭氧發酵后沼液，所以才會出現55℃高溫厭氧發酵沼液微藻培養組的整體表現優于35℃中溫厭氧發酵沼液微藻培養組的現象。

2.2 微藻培養液pH值

不同沼液用于微藻培養時培養液的pH值變化如圖2所示。

圖2 pH值的變化Fig.2 Variation of pH value

從圖中可以看出，各試驗組的pH值變化規律基本一致，即試驗開始后pH值先下降之后又逐漸上升，最后逐漸趨于穩定。這與霍書豪等[25]研究過程發現的pH值變化規律相一致，這是由于藻類在培養液中存在多種形態氮時，優先利用氨態氮[31]，而藻細胞利用氨分子，使得培養液中H+濃度增加，使培養液的pH 值在微藻培養的前期出現下降，之后隨著氨態氮質量濃度降低，同時沼液中的有機酸被降解，使培養液的pH值開始逐漸上升。從圖中還可以看出，在整個試驗過程中滅菌組的pH值整體均高于未滅菌組，這與高婷等[32]的研究結果相一致，各未滅菌試驗組的pH值在整個試驗過程中均維持在7.6～8.0，而各滅菌試驗組的pH值在整個試驗過程中均維持在8.56～9.0，經顯著性分析后差異達到極顯著水平(P<0.01),滅菌和未滅菌各試驗組的pH值均處于張虎等[33]研究得出的小球藻適宜生長的pH值范圍(7.0～9.0)。此外，從圖中還可以看出，各滅菌試驗組之間的pH值差值大于未滅菌組，在各滅菌試驗組中35℃厭氧發酵后沼液pH值在整個試驗過程中均高于55℃厭氧發酵后沼液試驗組，經顯著性分析后差異達到極顯著水平(P<0.01)，這是由于55℃厭氧發酵后沼液各試驗組的微藻生長速率均優于各自對應的35℃厭氧發酵后沼液試驗組，對氨氮和總氮的消耗量更大，在一定程度上使pH值下降，所以才會出現上述現象。

2.3 微藻培養液氨氮質量濃度

不同沼液用于微藻培養時培養液的氨氮質量濃度變化如圖3所示。

圖3 氨氮質量濃度的變化Fig.3 Variation of ammonia nitrogen concentration

從圖中可以看出，各試驗組的氨氮質量濃度變化規律基本一致，即試驗的前期(前2 d)各試驗組的氨氮質量濃度緩慢下降，試驗的中期(3～8 d)氨氮質量濃度開始快速下降，試驗的后期逐漸趨于穩定。從圖中還可以看出，試驗初期各試驗組的氨氮質量濃度差別較大，而且呈現出未滅菌組高于滅菌組的趨勢，而試驗后期未滅菌和滅菌各試驗組的氨氮質量濃度差別均較小，這主要是由于高溫滅菌過程造成了部分容易揮發的氨氮損失，使試驗初期未滅菌組的氨氮質量濃度高于滅菌組，而隨著試驗的進行較容易被微藻利用的氨氮[13]質量濃度迅速降低，試驗結束時所有試驗組的氨氮質量濃度均降低到較低水平，差別也較小，試驗結束時各試驗組氨氮質量濃度由試驗開始時的370～475 mg/L降到5～23 mg/L，各試驗組的氨氮去除率均高于92%，這說明微藻對沼液中的氨氮具有較顯著的去除效果。從圖中還可以看出，55℃厭氧發酵后沼液試驗組的氨氮質量濃度下降速度略高于35℃厭氧發酵后沼液試驗組，這與55℃厭氧發酵后沼液試驗組的微藻生長速率高于35℃厭氧發酵后沼液試驗組的結果相對應。

2.4 微藻培養液總氮質量濃度

不同沼液用于微藻培養時培養液的總氮質量濃度變化如圖4所示。

圖4 總氮質量濃度的變化Fig.4 Variation of total nitrogen concentration

從圖中可以看出，各試驗組的總氮質量濃度變化規律基本一致，即試驗的前期(前2d)各試驗組的總氮質量濃度緩慢下降，試驗的中后期總氮質量濃度開始快速下降。從圖中還可以看出，試驗初期各試驗組的總氮質量濃度差別相對較大，而且呈現出未滅菌組高于滅菌組的趨勢，經顯著性分析后達到極顯著水平(P<0.01)。而試驗后期未滅菌和滅菌各試驗組的總氮質量濃度差別均較小，總氮質量濃度的變化規律與氨氮質量濃度變化規律基本一致，這主要是由于在沼液中氨氮比例非常高[8,34]，所以氨氮質量濃度的變化規律直接影響了總氮質量濃度的變化規律。

2.5 微藻培養液總磷質量濃度

不同沼液用于微藻培養時培養液的總磷質量濃度變化如圖5所示。

圖5 總磷質量濃度的變化Fig.5 Variation of total phosphorus concentration

從圖中可以看出，各試驗組的總磷質量濃度變化規律基本一致，即試驗的前期(前2 d)各試驗組的總磷質量濃度緩慢下降，試驗的中后期總磷質量濃度開始快速下降。總磷質量濃度的變化規律與總氮質量濃度的變化規律一致。從圖中還可以看出，利用35℃厭氧發酵后未滅菌沼液培養微藻時，總磷的質量濃度在試驗的前6 d均高于其他各試驗組，而第6天后5號藻種組總磷質量濃度開始快速下降，并逐漸縮小與其他各組差距，而8號藻種組的總磷質量濃度始終保持緩慢下降的趨勢，試驗結束時35℃厭氧發酵后未滅菌沼液8號港口藻種試驗組的總磷去除率為69%，而其他各試驗組除55℃厭氧發酵后未滅菌沼液8號藻種試驗組的總磷去除率略低(為76%)以外，均維持在86%～94%，這與PRAJAPATI等[35]在研究過程中得到總磷去除率相近，總磷質量濃度的變化規律和去除率與微藻生長曲線圖中35℃厭氧發酵后未滅菌沼液8號藻種試驗組較低的微藻生長速率相對應。經顯著性分析后 35℃未滅菌8號藻種試驗組和5號藻種試驗組的差異不顯著。35℃未滅菌8號藻種試驗組與35℃滅菌5號藻種試驗組的差異達到顯著(P<0.05)水平，35℃未滅菌8號藻種試驗組與其他各試驗組的差異均達到極顯著(P<0.01)水平。

2.6 微藻培養液COD值

不同沼液用于微藻培養時培養液的COD值變化如圖6所示。

圖6 COD值的變化Fig.6 Variation of COD

從圖中可以看出，各試驗組的COD值變化規律基本一致，即試驗的前期(前2 d)各試驗組的COD值緩慢下降，試驗的中期(3～8 d)COD值開始快速下降，試驗的后期逐漸趨于穩定。從圖中還可以看出，試驗初期各試驗組的COD值差別較小，而試驗中后期各試驗組的COD值差別開始逐漸增大，而且呈現出5號藻種各試驗組的COD去除率均高于8號藻種各對應試驗組，而且8號藻種各試驗組的COD去除率呈現出55℃厭氧發酵后滅菌沼液試驗組高于其他各組的現象，這與各試驗組的微藻生長規律相對應，也說明55℃高溫厭氧發酵和滅菌處理均能顯著降低沼液對后續微藻培養的不利影響。各試驗組的COD值由試驗開始時的913～974 mg/L降到試驗結束時的141～272 mg/L，各試驗組的COD去除率均維持在72%～86%范圍內，這與MIN等[36]在研究中得到的COD去除率相近。COD值降低一方面是由于小球藻除了利用CO2作為碳源以外，還可以快速利用各種有機化合物作為碳源，這與LI等[37]的研究結果相一致；另一方面是由于微藻培養過程中通入的空氣中含有氧氣，這些氧氣提高了沼液中帶入的好氧和兼氧微生物以及空氣中的好氧微生物的活性，加速了培養液中有機物的降解，也導致了COD值的下降。所以上述兩個過程的共同作用才使培養液中COD值出現了大幅下降。

3 結論

(1)高溫55℃厭氧發酵后沼液用于微藻培養的整體表現優于中溫35℃厭氧發酵后沼液，微藻的生長速率更高。

(2)在本研究條件下，滅菌組與未滅菌組相比，在前期的適應期方面未表現出明顯的優勢，但在中后期的微藻生長速率方面略優于未滅菌組。高溫滅菌不僅會造成能耗的增加，也會造成氮素的損失。

(3)本研究所選定的ChlorellapyrenoidosaFACHB-5和ChlorellavulgarisFACHB-8兩種藻種均能較好地適應添加沼液的培養環境，但前者適應能力優于后者。利用沼液培養微藻，微藻可以顯著降低沼液中的氨氮質量濃度、總氮質量濃度、總磷質量濃度和COD值，對沼液具有較好的凈化效果。

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