畢赤酵母對酸粥滋味品質形成的評價

折米娜，王玉榮，劉康玲，雙 全*

（內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

作為流行于陜北、晉北以及內蒙古西部地區的傳統發酵食品，酸粥通常以糜米、大米、小米和糯米等為原料，通過自然發酵而成[1]。酸粥中的產酸細菌包括乳酸菌和醋酸菌，杜曉華[2]研究發現，內蒙古西部地區自然發酵酸粥中的乳酸菌主要為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（L.plantarum）和瑞士乳桿菌（L.helveticus）；常健[3]發現晉西北地區酸粥中的醋酸菌主要為沖繩醋酸桿菌（Acetobacter okinawensis）和蘭比克醋酸桿菌（Acetobacter lambici）。傳統發酵食品的制作環境相對開放，其微生物主要來源于外界環境，雖然乳酸菌等微生物的存在對發酵食品品質的形成具有積極的意義，但其中可能亦存在部分致病菌或條件致病菌[4]。有研究發現，部分畢赤酵母屬真菌的大量繁殖可引起泡菜表面長白膜并產生不愉快的酸臭味[5]。酸粥中亦存在大量真菌，李文亞等[6]發現，晉西北地區酸粥中的酵母菌主要為庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），然而目前關于酵母菌對酸粥品質影響的研究報道尚少。

滋味作為食品品質的重要構成部分，其好壞直接決定了消費者對食品的接受度。近年來國內學者在酸粥滋味品質評價方面開展了大量的研究，構建了一套酸粥滋味品質評價體系[7-8]，然而這些方法均基于感官鑒評法，具有受主觀因素影響大、在一定程度上很難保證結果準確性的不足[9]。電子舌技術實現了食品滋味品質的數字化評價，具有對味覺物質選擇性高和結果準確的優點[10]，目前已在酒類[11]、咖啡[12]、調味品[13]和奶粉[14]等方面有了廣泛的應用。

本研究以分離自內蒙古巴彥淖爾市酸粥中的酵母菌為研究對象，通過單一發酵和與乳酸菌復配發酵相結合的手段進行了酸粥樣品的制備。在使用高效液相色譜法對酸粥有機酸構成進行解析的基礎上，進一步采用電子舌技術和多元統計學相結合的手段，探討了畢赤酵母在酸粥滋味品質形成過程中的作用，以期為后續酸粥的產業化生產提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陰離子溶液、陽離子溶液和參比溶液：日本Insent公司提供；糜米：市售；分離自內蒙古巴彥淖爾市酸粥中的酵母菌和乳酸菌：由內蒙古農業大學食品科學與工程學院民族特色食品研發團隊提供；磷酸二氫鉀、磷酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸標準品：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SA 402B味覺分析系統：日本Insent公司；LXJIIB低速大容量多管離心機：上海安亭科學儀器廠；LC-20ADXR高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；PHS-25型數顯pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Ultra Scan PRO色度儀：美國Hunter Lab公司；AntonAbbemat350全自動折光儀：奧地利安東帕（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酸粥制作工藝

將糜米淘凈瀝干后，按照1∶3（g∶mL）的比例加蒸餾水，于65℃水浴加熱30 min，冷卻后以接種量5%（V/V）分別接種微生物發酵，于30℃發酵30 h后煮沸15 min，置于4℃備用。其中乳酸菌組只接入乳酸菌；酵母菌組只接入酵母菌；復配組各接種2.5%（V/V）的乳酸菌和酵母菌。菌株及復配信息如表1所示。

表1 不同組的菌株及復配信息Table 1 Information of single and compound strains

1.3.2 酸粥常規理化指標的測定

參照GB5009.237—2016《食品pH值的測定》對酸粥pH值進行測定；參照國標GB/T 15038—2006《食品中總糖的測定》中直接滴定法對酸粥總糖進行測定；使用自動折光儀對可溶性固形物進行測定。

色度測定參照潘婷等[15]的方法并稍作修改。即：色度儀校正后，將酸粥樣品裝入50 mm×50 mm比色皿中，使用反射模式進行色度測定，讀數以色度空間值L*值（暗→亮：0→100），a*值（綠→紅+），b*值（藍→黃+）表示。

1.3.3 酸粥酸、苦、澀、咸、鮮等基本味及澀、苦和鮮味回味的測定

滋味測定參照王玉榮等[16]的方法做適當修改，即：

1）傳感器CA0、CT0、AAE、C00和AE1于陽離子溶液或陰離子溶液中浸泡90s，以除去吸附在傳感器上的干擾物質；

2）各傳感器在參比溶液1和2中洗滌120 s；

3）各傳感器在參比溶液3中浸泡30 s，測得Vr值；

4）各傳感器在某酸粥樣品中浸泡30 s，測得Vs值，通過計算各傳感器Vs-Vr值，可對酸粥樣品的酸、苦、澀、咸和鮮味等5個基本味進行評價分析；

同時按照下列步驟對三個回味：后味A（澀回味）、后味B（苦回味）以及豐度（鮮回味）進行測定：

1）傳感器AAE、C00和AE1置于參比溶液4、5中洗滌30s；2）各傳感器在參比溶液6中浸泡3 s，測得電勢值Vr’；通過計算各傳感器Vr’-Vr值，可對酸粥樣品后味A（澀回味）、后味B（苦回味）和豐度（鮮的回味）進行評價分析。其中，參比溶液1～6的組分均相同[17]。為減少系統誤差，測定重復4次，取后3次數據作為最終分析數據。

1.3.4 酸粥有機酸含量的測定

采用HPLC法測定酸粥有機酸含量。分別配制質量濃度為0.001～3.000g/L梯度的草酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸和乙酸等7種有機酸標準工作液，用0.45 μm濾膜過濾，備用。高效液相色譜條件：流動相為0.01 mol/L KH2PO（4pH=2.9）溶液；色譜柱為Inertsil C18液相色譜柱（250mm×4.6mm，φ5μm）；檢測器為紫外吸收檢測器，檢測波長為215 nm；柱溫為30℃；流速為0.8 mL/min；進樣量為10 μL。將有機酸質量濃度設定為橫坐標x（g/L），峰面積設定為縱坐標y，采用外標法進行回歸方程計算。使用流動相將酸粥樣品稀釋后，用0.45 μm水相濾膜過濾，參照上述色譜條件進行上機檢測后，將測試的各有機酸峰面積代入回歸方程，即可求得酸粥中各對應有機酸的質量濃度。

1.3.5 統計分析

使用配對t檢驗、主成分分析（principal component analysis，PCA）、典范對應分析（canonical correspondence analysis，CCA）、馬氏距離（Mahalanobis distance）和多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）對酸粥滋味品質整體結構的差異性進行分析，使用冗余分析（redundancy analysis，RDA）對與酸粥滋味品質整體結構差異顯著相關的指標進行分析。除RDA采用Canoco4.5軟件外，其余分析均采用Matlab 2010b軟件、Origin8.5軟件（OriginLab，MA，USA）作圖。

2 結果與分析

2.1 酸粥各滋味指標相對強度的變化

本研究利用電子舌技術對30個酸粥樣品的滋味進行評價分析，其各滋味相對強度如圖1所示。

由圖1可知，30個酸粥樣品中酸味、苦味、澀味、咸味以及鮮味五個基本味的極差值均＞1，分別為34.98、5.14、11.34、20.73和12.30，說明通過感官鑒定的方法可以區分各酸粥樣品間滋味的差異[18]。相反，其后味A（澀回味）、后味B（苦回味）和豐度等三個回味指標的極差值均小于1，說明回味對酸粥的滋味影響較小。由此推測影響酸粥品質差異性的可能是酸味、咸味、鮮味、澀味以及苦味。同時利用配對t檢驗方法對各組發酵酸粥滋味數據進行差異性分析，結果如表2所示。

圖1 酸粥滋味指標箱形圖Fig.1 Box figure of sour porridge taste of various indicators

表2 不同菌株發酵酸粥各滋味指標差異性分析Table 2 Significance analysis of each taste index of sour porridge fermented by different strains

由表2可知，酵母菌組發酵酸粥與其余兩組發酵酸粥的滋味存在明顯差異，其中酸味、苦味、澀味、咸味和鮮味等基本味指標表現出顯著差異（P＜0.05），從而驗證了上述結論。同時由表2可知，乳酸菌組發酵酸粥樣品中酸味和澀味相對強度較高，苦味、咸味和鮮味相對強度較低，然而與酵母菌復配發酵后，各滋味指標相對強度均有變化。其中酸味、苦味、咸味和鮮味相對強度升高，而澀味相對強度降低。由表2亦可知，三組發酵酸粥的苦味指標呈現出極顯著差異（P＜0.001），而在酸味、澀味、咸味、鮮味和后味A等指標差異非常顯著（P＜0.01），相反后味B指標差異不顯著（P＞0.05）。

結合圖1和表2可知，酸味對發酵酸粥的滋味有著重要影響。本研究進一步采用高效液相色譜法對質量濃度為0.001～3 g/L梯度的有機酸標準液進行檢測分析，并通過計算各有機酸相關系數，對各組發酵酸粥中的有機酸含量進行測定，結果如表3所示。

表3 不同菌株發酵酸粥有機酸含量相關性分析Table 3 Correlation analysis of organic acid contents of sour porridge fermented by different strains

由表3可知，7種有機酸的峰面積與其質量濃度在回歸方程上表現出良好的線性相關，回歸系數均＞0.99。其中酵母菌組發酵酸粥中草酸、琥珀酸、乳酸和乙酸含量均比其余兩組發酵酸粥少，而檸檬酸含量較高，未檢測出酒石酸。同時三組發酵酸粥乳酸含量呈現出差異極顯著（P＜0.001），草酸和琥珀酸含量呈現出差異非常顯著（P＜0.01），而其他有機酸差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 不同菌株發酵酸粥滋味品質評價

主成分分析（PCA）是一種將具有一定相關性的原始數據，通過線性擬合得到新的綜合變量的數據統計方法，其不僅可以保留原始變量信息，使彼此之間互不相關，同時可以對不同組樣品間的差異性進行定性分析[19-20]。經PCA結果發現，酸粥滋味品質的信息主要集中在前2個主成分，第一主成分貢獻率為81.15%，包括酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、后味A和豐度，第二主成分貢獻率為13.1%，主要由后味B組成。前兩個主成分因子得分如圖2所示。

圖2 不同菌株發酵酸粥滋味PC1和PC2因子得分圖Fig.2 Factors score diagram of PC1 and PC2 of the taste profile of sour porridge fermented by different strains

由圖2可知，本研究三組發酵酸粥在空間排布上呈現出明顯的分離趨勢。其中，乳酸菌組和復配組發酵酸粥主要集中左側，而酵母菌組發酵酸粥主要集中在右側。對比PCA無監督的空間排布方法，典范對應分析（CCA）是一種有監督的空間排布方法，可有效彌補PCA的局限性[21]。

圖3 基于CCA分析的不同菌株發酵酸粥滋味品質評價Fig.3 Evaluation on the taste quality of sour porridge fermented by different strains based on CCA analysis

由圖3可知，三組發酵酸粥同樣在空間排布上呈現出連續性，有明顯的分離現象。乳酸菌組和復配組發酵酸粥主要集中在第二、三象限，酵母菌組發酵酸粥主要集中在第一、四象限。結合PCA，酵母菌組發酵酸粥與其他兩組相比，滋味品質存在明顯差異。考慮到各組發酵酸粥之間的聯系，馬氏距離是一種有效計算兩個未知樣本的相似度的方法[22]。

圖4 基于馬氏距離的不同菌株發酵酸粥滋味品質評價Fig.4 Evaluation on the taste quality of sour porridge fermented by different strains based on Mahalanobis distance

由圖4可知，乳酸菌組與復配組發酵酸粥的滋味品質較為相似，而與酵母菌組發酵酸粥滋味差異較大。本研究進一步使用MANOVA對三組發酵酸粥的整體滋味品質的差異性進行分析，結果發現乳酸菌組與復配組發酵酸粥的滋味品質呈現出不顯著差異（P＞0.05），而與酵母菌組發酵酸粥呈現出極顯著差異（P＜0.001），由此認為不同菌株發酵酸粥樣品間滋味品質存在一定的差異性。然而酵母菌組發酵酸粥與其他兩組發酵酸粥存在的差異是由哪些滋味指標導致的，是本研究需要進一步解決的問題。

2.3 不同菌株發酵酸粥滋味品質差異性分析

冗余分析（RDA）是通過原始變量與典型變量之間的相關性，進一步分析引起原始變量變異的原因的一種排序方法[23]。為繼續探討酵母菌組發酵酸粥與其他兩組發酵酸粥滋味品質整體結構間的差異，研究采用RDA對各滋味指標行進行進一步的分析，結果如圖5所示。

圖5 不同菌株發酵酸粥各滋味指標的冗余分析雙序圖Fig.5 RDA biplot of taste indexes of sour porridge fermented by different strains

由圖5可知，苦味和咸味指標在RDA排序圖約束軸上呈現良好相關，則認為上述兩個指標代表了不同菌株發酵酸粥整體滋味品質差異顯著相關的主要滋味。由圖5亦可知，苦味和咸味位于酵母菌組一側，說明酵母菌組發酵酸粥的苦味和咸味相對強度較高。綜上所述，認為導致酵母菌組發酵酸粥與其他兩組發酵酸粥滋味品質存在差異的主要滋味指標是苦味和咸味。

據相關文獻報道，酵母菌可以在食品表面滋生，成為肉眼可見的無光澤、干或黏滑的菌膜并引起變色[24]。在乳制品[25]、肉制品[26]和果蔬[27]等食品中均有發現畢赤酵母，而這些酵母菌在一定程度上具有潛在致病性[28]。在酸粥發酵過程中，畢赤酵母菌發酵會有膜璞生成且伴有不愉快的氣味，而與乳酸菌復配發酵后無此現象，且與乳酸菌組酸粥的滋味無顯著差異（P＞0.05），即添加畢赤酵母菌發酵后對酸粥的滋味品質影響較小。

2.4 不同菌株發酵酸粥理化指標的比較分析

本研究進一步利用配對t檢驗方法對不同菌株發酵酸粥各理化指標的差異性進行了分析，其結果如表4所示。

表4 不同菌株發酵酸粥理化指標差異性分析Table 4 Difference analysis of physical and chemical indexes of sour porridge fermented by different strains

由表4可知，三組發酵酸粥的色度（L*值、a*值、b*值）和總糖差異不顯著（P＞0.05），而在pH和可溶性固形物呈現出差異顯著（P＜0.05）。其中酵母菌組發酵酸粥pH值較高，酸性較弱，復配組發酵酸粥pH值較低，酸性較強，造成差異性的原因可能是因為一些畢赤酵母產酸能力弱，但是與乳酸菌復配發酵就會產酸過多，從而使兩組發酵酸粥的pH存在顯著差異（P＜0.05）[29]。

3 結論

本研究以分離自內蒙古巴彥淖爾市酸粥中的畢赤酵母和乳酸菌為研究對象，通過單一發酵和復配發酵相結合的手段進行了酸粥樣品的制備，并采用電子舌對酸粥的滋味品質進行了評價。研究發現，乳酸菌單獨發酵及與畢赤酵母菌復配發酵制備的酸粥滋味品質無顯著差異，加之畢赤酵母菌在酸粥發酵過程中常形成膜醭且具有一定的致病性，因而畢赤酵母對酸粥滋味品質形成無積極影響。通過本研究的實施對后續酸粥用直投發酵劑的制備及酸粥的產業化發展提供了一定理論參考。

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